Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A transformaÃÃo genÃtica de plantas atualmente representa uma importante ferramenta para investigaÃÃo da funÃÃo de genes de diversas origens como plantas, fungos, vÃrus, nematÃides e bactÃrias, sendo os de origem bacteriana os mais representativos. Dentro desse contexto, seqÃÃncias codificando para domÃnios contendo repetiÃÃes YD (tirosina- Ãcido aspÃrtico), que possuem similaridades com proteÃnas nematicidas, foram previamente detectadas no genoma de Chromobacterium violaceum estirpe ATCC 12472. Dentre essas seqÃÃncias, a ORF CV1887 (4.155 pb) foi selecionada para clonagem e expressÃo no sistema heterÃlogo, objetivando validar a atividade determinada in silico na anotaÃÃo do genoma de C. violaceum. A estratÃgia experimental consistiu em clonar as seqÃÃncias completa (4.155 pb) e parcial (2.642 pb) da ORF CV1887 no vetor binÃrio pBI121. Os vetores recombinantes foram introduzidos em cÃlulas de Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404, por eletroporaÃÃo. Empregando-se o sistema de agroinfecÃÃo, segmentos foliares de Nicotiana tabacum var. Xanthi foram transformados e usados como propÃgulos para regeneraÃÃo dos transformantes primÃrios. A confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica foi feita por reaÃÃo da polimerase em cadeia (PCR), sendo usado como molde, o DNA genÃmico extraÃdo de clones selecionados em meio de cultura contendo canamicina. Pela visualizaÃÃo das bandas no gel de agarose, dos 19 clones selecionados de CV1887 parcial, 84% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb e dos 13 clones selecionados de CV1887 completo, 78% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 4.155 pb. Para a anÃlise da expressÃo, foram selecionados trÃs clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 parcial, dois clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 completa, trÃs clones transformados com o gene repÃrter gus, que codifica para a enzima β-glucoronidase, e dois clones de plantas controle nÃo transformadas. O RNA extraÃdo dos clones selecionados foi utilizado em uma reaÃÃo de RT-PCR para a sÃntese do cDNA e amplificaÃÃo das seqÃÃncias correspondentes. Os produtos da amplificaÃÃo foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose, constatando-se a presenÃa de bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb para os trÃs clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 parcial e no tamanho de 1.812 pb para os trÃs clones transformados com gus, confirmando-se a presenÃa dessas seqÃÃncias nas cÃlulas transformadas. NÃo foi confirmada a presenÃa, nos clones transformados, da seqÃÃncia CV1887 completa. / The genetic transformation of plants represents today an important tool to
investigate the function of genes of diverse origins like plants, fungi, virus, nematodes and
bacteria. Those that come from bacteria are the most representative ones. Within this context,
sequences coding to domains containing YD (tyrosine
-
asparatate) repetitions, that have
similarities with nematicide proteins, were detected in the Chromobacterium violaceum
strain ATCC 12472 genome. Among these sequences, the ORF CV1887 (4.155 bp) was selected for
cloning and expression in the heterologous system, in the attempt to
validate its activity determined
in silico
in the
C. violaceum
genome's annotation. The experimental strategy
consisted in cloning the complete (4.155 bp) and the partial sequence (2.642 bp) of the ORF
in the binary vector pBI121. The recombinant vectors w
ere introduced in
Agrobacterium
tumefaciens
strain LBA4404 cells by electroporation. By utilizing agroinfection system,
leaves segments of
Nicotiana tabacum
var.
Xanthi
were transformed and used as propagles
for regeneration of the firsts transformants. Th
e confirmation of the genetic transformation
was achieved by PCR with the genomic DNA extracted from of the selected clones, followed
of a PCR reaction. The visualization of bands in the agarose gel electrophoresis showed that
from the 19 clones with the p
artial sequence cv1887 that were selected, 84% showed bands
with approximate size of 2.642 bp, and from the 13 clones with the complete sequence
CV1887 that were selected, 78% showed bands with approximate size of 4.155 bp. For the
expression analysis, the
following were selected: three transformed clones with partial
sequence CV1887, two transformed clones with complete sequence CV1887, three clones
transformed with the reporter gene
gus,
which encodes for the enzyme
b
-
glucoronidase,
and
two control clone
s of non
-
transformed plants. The RNA from the selected clones was used in
a RT
-
PCR reaction for cDNA synthesis and amplification of the corresponding sequences.
The products of the amplification were analyzed in an agarose gel electrophoresis, showing
the presence of bands with 2.642 bp for the three clones transformed with partial sequence
CV1887 and 1.812 bp for the three clones transformed with gus and it is confirmed the
presence of these sequences in the transformed cells. It was not confirmed the pres
ence in transformed clones, the complete sequence CV1887.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:3102 |
| Date | 26 September 2009 |
| Creators | Sandra Mara Serafim Ribeiro |
| Contributors | Cristina Paiva da Silveira Carvalho |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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