As reações luminosas da fotossíntese em plantas envolvem quatro complexos proteicos multi-unidades na membrana dos tilacóides incluindo o fotossistema II (PSII), o complexo citocromo b6f, o fotossistema I (PSI) e o complexo ATP sintase. Uma atividade apropriada desse processo exige um mecanismo de controle de qualidade mediado por chaperonas, DnaJs e proteases, como o complexo FtsH. Esse conjunto de proteínas garantem um dobramento correto de proteínas, as montagens devidas dos complexos e a degradação de algumas subunidades danificadas quando necessário. Neste trabalho nós mostramos o envolvimento de FIP, uma proteína com um domínio dedo-de-zinco localizada nos tilacóides de cloroplastos de A. thaliana, no mecanismo de resposta à estresses abióticos. Plantas mutantes fip foram, fenotipicamente, mais tolerantes à estresses abióticos de alta luminosidade, elevado potencial osmótico e excesso de sal. Também mostramos que a expressão de FIP é diminuída em resposta às diferentes condições de estresse, assim como o acúmulo de transcritos de genes relacionados à estresse foi menor nas plantas mutantes fip. Análises por immunoblot mostraram que os mutantes fip acumulam menos proteínas PsaA e PsaB do fotossistema I e plastocianina (PC) do que as plantas selvagens, no entanto não são afetados quanto ao acúmulo de proteínas do fotossistema II e do Complexo do Citocromo b6f sob condições controle. Esses mutantes também acumulam menos FtsH5 nos tilacóides, sem afetar a eficiência dos fotossistemas I e II. Foi testado também o potencial redutase do domínio dedo-de-zinco da proteína recombinante FIP (6xHis-FIP) em ensaios in vitro de redução de insulina. Vimos que FIP apresenta atividade redutase, significantemente, maior que o controle negativo nas condições testadas. Considerando todos os resultados obtidos até o momento, acreditamos que FIP possa estar agindo como uma redutase na membrana dos tilacóides, tendo como alvos não somente FtsH5, mas também outras proteínas com resíduos de cisteína nas suas estruturas, e que sua atividade tem influência no acúmulo de proteínas dependentes de redução para a maturação como PsaA, PsaB e PC. Uma investigação mais aprofundada da atividade de FIP nos cloroplastos ainda é necessária para o completo entendimento da sua função. / The light-driven photosynthetic reactions in plants take place within four multi- subunit protein complexes in the thylakoid membranes, including photosystem II (PSII), the cytochrome b6f complex, photosystem I (PSI) and the ATP synthase complex. Regulation of all these molecular machineries requires a fine-tuning control mechanism mediated by specific proteins, including chaperones, DnaJs, and proteases, such as the FtsH complex. These set of proteins guarantee the proper folding, assembly and degradation of the photosynthetic complexes\' subunits. In this work we showed the involvement of FIP, a zinc-finger protein localized in the thylakoid membranes in A. thaliana, in the abiotic stress response mechanism. Mutants fip knockdown plants were phenotypically more tolerant to abiotic stresses like high light, increased osmotic potential and salt excess. We also showed that FIP is down-regulated by different abiotic stresses, with lower levels of stress-related gene transcripts accumulation in mutant fip plants. Analysis of accumulation of photosynthetic proteins by immunoblot under control conditions showed that mutants fip displayed lower levels of PsaA, PsaB (PSI) and Plastocyanin (PC) proteins than wild-type plants, however are not affected for PSII and Cyt b6f proteins accumulation under the same growth conditions. In addition, the mutants accumulated slightly less FtsH5 proteins in thylakoid membranes, without affecting PSII and PSI efficiency. We tested the putative reductase activity probably mediated by FIP zinc-finger domain, using the recombinant form of the protein 6xHis-FIP in in vitro insulin reduction assays. FIP presented a reductase activity higher than the negative control under the same assay conditions. Taking all together, these results suggest that FIP may be acting as a reductase in the thylakoid membranes, having as targets not only FtsH5 but other targets with available cysteine residues, depending on the reduction step for proper accumulation such as PsaA, PsaB and PC. Further investigations regarding the role of FIP in chloroplasts are still necessary to completely understand its function.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29082019-163011 |
| Date | 04 July 2019 |
| Creators | Lopes, Karina Letícia |
| Contributors | Silva Filho, Marcio de Castro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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