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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 323099.pdf: 659120 bytes, checksum: 22fb47aff929dadd499b8af2f917d0b1 (MD5) Previous issue date: 2013 / O estresse é capaz de afetar vários processos fisiológicos e, portanto, é considerado como determinante no desenvolvimento de diversas patologias. A exposição a estímulos estressores é responsável por alterações na regulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) que, por sua vez, são capazes de induzir uma elevação na secreção de glicocorticóides, hormônios esses reconhecidos como marcadores biológicos de grande importância na resposta ao estresse. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do modelo proposto de estresse por instabilidade social (IS) e validá-lo como modelo indutor de estresse. Para tanto, camundongos machos suiços presenciaram, a curta distância e sem contato físico direto, lutas entre animais mais velhos. Os episódios de luta foram promovidos por 30 minutos e aplicados por um ou quatro dias consecutivos. O nível de estresse, após a exposição ao modelo de instabilidade social, foi mensurado pelas análises da concentração plásmática dos hormônios, adrenocorticotrópico (ACTH) e corticosterona, da atividade da enzima glutationa redutase (GR) e a expressão do comportamento do tipo ansiedade. Os resultados mostraram que o modelo de estresse por IS gerou reações típicas de estresse com ativação do eixo HPA e alterações na atividade da enzima GR. Observou-se que as exposições repetidas (quatro) ao modelo de IS foram capazes de induzir um efeito cumulativo que se refletiu sobre os níveis elevados de ACTH e corticosterona, sobretudo quando comparados com os níveis desses hormônios em uma única exposição a IS. Em adição, verificou-se que a exposição a um estímulo heterotípico, após a aplicação do modelo de IS, foi responsável pela redução da atividade exacerbada do eixo HPA e da atividade da enzima GR, observada anteriormente pela exposição ao estresse de IS. Em conjunção, os dados do presente estudo indicam que o protocolo de instabilidade social proposto é um modelo válido e eficaz para a indução de estresse de natureza psicossocial. <br> / Abstract : Stress can affect various physiological processes and thus is considered a key factor in the development of several pathologies. The exposure to stressful stimuli is responsible for alterations in the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) which, in turn, are capable of inducing an increase in the secretion of glucocorticoids, recognized as biological markers of great importance in response to stress. The aim of this study was to evaluate the effects of the proposed model of social instability stress (IS) and validate it as a model of stress inducer. Therefore, male Swiss mice witnessed fights between older animals in a short distance, without direct physical contact. The fighting episodes were promoted for 30 minutes and applied in one or four consecutive days. After exposure to the model of social instability, the stress level was measured by analysis of plasma concentrations of adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticosterone, Glutathion Reductase (GR) enzyme activity and expression of anxiety-like behavior. The results showed that the model of IS generated typical reactions to stress with HPA axis activation and changes in the activity of the enzyme GR. It was observed that repeated exposure (four) to IS model was able to induce a cumulative effect which was reflected on high levels of both hormones, especially when compared with the levels of these hormones in a single exposure to IS. In addition, the exposure to a stimulus heterotypic, after applying the model IS, was responsible for reducing the heightened activity of the HPA axis and GR enzyme activity, previously observed by exposure to stress IS. In conjunction, the data of this study indicate that the protocol of social instability stress is a valid and effective model for the induction of psychosocial stress.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T12:26:10Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18256 bytes, checksum: ec60d71ddac70af12d876c9945806d90 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T12:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18256 bytes, checksum: ec60d71ddac70af12d876c9945806d90 (MD5) Previous issue date: 2005-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram realizadas a clonagem e a caracterização parcial de um fragmento de 7,1Kb contendo o gene que codifica a nitrato redutase no fungo basidiomiceto Crinipellis perniciosa. A análise da seqüência parcial desse fragmento revelou a organização em cluster do gene nia com o gene que codifica a nitrito redutase e permitiu uma comparação filogenética com seqüências homólogas em outros fungos filamentosos. Foi realizada, também, a análise parcial comparativa das seqüências putativas das proteínas homólogas ao regulador geral positivo AREA, ao regulador específico NIRA e ao transportador de nitrato CRNA, depositadas no banco de dados do projeto genoma de C. perniciosa. O alinhamento das seqüências revelou maior proximidade genética de C. perniciosa ao fungo basidiomiceto Hebeloma cylindrosporum. A caracterização do gene nia em dez isolados de C. perniciosa de distintos biótipos e regiões geográficas por PCR-RFLP e hibridização revelou polimorfismo para os isolados do biótipo-S e biótipo-L. Não foi possível agrupar os isolados por hospedeiro ou região geográfica a partir da comparação das seqüências do gene que codifica a nitrato redutase, porém, os dados evidenciaram variabilidade genômica intraespecífica nessa espécie. A transformação da linhagem mutante niaD- de Penicillium griseoroseum, PG63, com o plasmídeo contendo o fragmento de 7,1 Kb resultou no isolamento de poucos transformantes. A complementação da mutação em P. griseoroseum, com o gene heterólogo do basidiomiceto C. perniciosa demonstrou que o gene niaCP é expresso e funcional, sugerindo estar sujeito a um controle de regulação similar ao do gene niaD desse organismo. A análise da regulação do gene nia de C. perniciosa por RT-PCR foi feita a partir de RNA total extraído de micélio cultivado em diferentes fontes de nitrogênio. O transcrito detectado na presença de nitrato como indutor e ausência de fontes de nitrogênio prontamente metabolizáveis sugere uma via de regulação específica e geral. A transcrição do gene niaCP foi ativada também no micélio cultivado no meio acrescido do fruto de cacau liofilizado e moído. Estes resultados sugerem uma provável importância da enzima nitrato redutase para C. perniciosa durante o seu desenvolvimento no hospedeiro. / In this study cloning and partial characterization of a 7.1Kb fragment containing the gene that encodes nitrate reductase in the basidiomycete fungus Crinipellis perniciosa were performed. The analysis of the partial sequence of this fragment revealed a cluster organization of nia gene with the gene encoding nitrite reductase and allowed a phylogenetic comparison among homologous sequences of other filamentous fungi. A partial comparative analysis was done for putative sequences of proteins homologous to the positive general regulator AREA, the specific regulator NIRA and the nitrate transporter CRNA deposited in the data bank of the genome project of C. perniciosa. Sequences alignment revealed a closer genetic proximity of C. perniciosa to Hebeloma cylindrosporum. The characterization of nia gene in ten isolates of C. perniciosa from different biotypes and geographic regions of C. perniciosa by PCR-RFLP and hybridization revealed a polimorfism for isolates of the biotype S and biotype L. It was not possible to group the isolates by host or geographic region through nitrate reductase gene sequences, but these data evidenced an intraspecific genomic variability in this species. The transformation of niaD- mutant of Penicillium griseoroseum, PG63, with the plasmid containing the xi7.1Kb fragment resulted in the isolation of few transformants. The complementation of the mutation in P. griseoroseum with the heterologous gene of the basidiomycete C. perniciosa showed that niaCP gene is expressed and functional, which suggests that it is under a regulation control similar to the one of niaD gene of this organism. The analysis of the regulation of nia gene in C. perniciosa by RT-PCR was performed from total RNA extracted from cultivated mycelium in different nitrogen sources. The transcript detected in the presence of nitrate as inductor and in the absence of nitrogen sources readily metabolized suggests a specific and general regulation pathway. The transcription of niaCP gene was also activated in the mycelium cultivated in the medium added with lyofilized and triturated cacao fruit. These results suggest a probable importance of the nitrate reductase enzyme for C. perniciosa during its development in the host.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-10T16:44:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 604815 bytes, checksum: 299964cd825884ce449176c3d3e98887 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T16:44:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 604815 bytes, checksum: 299964cd825884ce449176c3d3e98887 (MD5) Previous issue date: 2001-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum foi isolado de um banco genômico construído no vetor fago lambda EMBL3. Um fragmento de DNA de 3,17 Kb, contendo parte da região codificadora do gene da nitrato redutase de Penicillium chrysogenum, foi utilizado como sonda. Quatro fagos recombinantes foram isolados e denominados λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, com fragmentos de DNA clonados de 14,4; 14,4; 12,3 e 12,6 Kb, respectivamente. A análise por hibridização do DNA dos fagos recombinantes, clivado com Sal I, identificou fragmentos cujos tamanhos correspondiam a 4,7 Kb (λPENR1), 6,0 Kb (λPENR3), 8,4 Kb (λPENR5) e 7,6 Kb (λPENR6). Para a construção do mapa físico de restrição do fago recombinante λPENR3, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. A análise de restrição e hibridização dos fragmentos de DNA do fago recombinante λPENR3 revelou que o gene nia estava presente em um fragmento de 6,5 Kb. Este fragmento foi subclonado no plasmídeo pBluescript SK+, e o plasmídeo recombinante foi denominado pPENR. Para a construção do mapa físico de restrição de pPENR, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. O plasmídeo recombinante pPENR foi utilizado na transformação dos mutantes Nia^- de P. expansum e Penicillium griseoroseum, sendo obtida uma freqüência de 16 transformantes por μg de DNA. / The gene encoding nitrate reductase from Penicillium expansum was isolated from a lambda EMBL3 genomic DNA library. A 3.17 Kb DNA fragment containing part of the coding region for nitrate reductase from Penicillium chrysogenum was used as a probe. Four recombinant phages were isolated and the recombinant phages were labeled λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, containing cloned DNA fragments of 14.4; 14.4; 12.3 and 12.6 Kb, respectively. DNA hybridization analysis of the recombinant phages cleaved with Sal I identified DNA fragments whose sizes were 4.7 Kb (λPENR1), 6.0 Kb (λPENR3), 8.4 Kb (λPENR5) and 7.6 Kb (λPENR6). For the construction of the a physical restriction map of the recombinant phage λPENR3, single and double digestions with restriction enzimes were performed. Restriction and hybridization analysis of the recombinant phage λPENR3 DNA fragments showed that the nia gene was present in a 6.5 Kb DNA fragment. This fragment was subcloned in the plasmid pBluescript SK+ resulting in plasmid pPENR. For the construction of the a physical restriction map of pPENR, single and double digestions with restriction enzymes were carried out. The recombinant plasmid pPENR was used for transformation of nitrate non-utilising strains of P. expansum and Penicillium. griseoroseum, and a frequency of 16 transformants per μg of DNA was achieved.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-11T20:28:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Final Quezia Anders.pdf: 644683 bytes, checksum: 1bfa19d42dd062b28b6e8bd77174f34f (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-05-17T15:56:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Final Quezia Anders.pdf: 644683 bytes, checksum: 1bfa19d42dd062b28b6e8bd77174f34f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T15:56:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Final Quezia Anders.pdf: 644683 bytes, checksum: 1bfa19d42dd062b28b6e8bd77174f34f (MD5) / CAPES / A enzima Metiltetrahidrofolato redutase (MTHFR), responsável pela liberação da forma ativa de folato no organismo, pode ter sua eficiência reduzida mediante a presença dos polimorfismos MTHFR C677T e A1298C. Considerando que o folato participa de vias metabólicas como a síntese de nucleotídeos e metilação de biomoléculas, o estudo desses polimorfismos torna-se relevante na associação de dados prognósticos em pacientes com carcinoma epidermoide oral, de orofaringe e de laringe tratados ou não com radioterapia. Objetivou-se estudar os polimorfismos C677T (rs1801133) e A1298C (rs1801131) do gene MTHFR como possíveis marcadores de radiossensibilidade tumoral em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. A casuística foi composta por 306 pacientes avaliados segundo aos dados clinicopatológicos, recidiva local, óbito, sobrevida doença específica, de acordo com a modalidade terapêutica utilizada para cada um desses casos. Para análise dos polimorfismos utilizou-se a técnica PCR-RFLP. As curvas de sobrevidas foram avaliadas segundo o modelo Kaplan-Meier, e sua significância confirmada pelo valor de p de Wilcoxcon, sendo a margem de erro estipulado menor que 5%. Dentre as características prognósticas, as associações de recidiva local, óbito e sobrevida livre de doença local não apresentaram resultados estatisticamente significativos para ambos polimorfismos em nenhum sítio anatômico analisado. Entretanto, os pacientes com carcinoma epidermoide de laringe tratados com radioterapia, apresentaram dados significantes quando associados ao polimorfismo MTHFR C677T. Esta associação demonstrou que a presença de pelo menos um alelo T, ou seja, a troca de um aminoácido alanina por uma valina na enzima MTHFR, diminui em até três vezes a chance de o paciente vir a óbito precocemente. Conclui-se assim, que o polimorfismo MTHFR C677T pode ser um importante biomarcador para avaliação prognóstica de pacientes com carcinoma epidermoide de laringe tratados com radioterapia. / The enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), responsible for the biological release of folate’s active form, may have reduced activity when polymorphic variants C677T and A1298C are present. Considering that folate participates in metabolic pathways that lead to nucleotide synthesis and methylation, these polymorphisms are relevant for the prognostic association with oral, oropharynx and larynx squamous cell carcinoma treated with radiotherapy or not. This study analysed polymorphisms C677T (rs1801133) and A1298C (rs1801131) as putative markers of tumor radiosensitivity. Our sample was made of 306 patients evaluated according to clinicopathological data, local disease relapse, death, disease specific survival, in relation to therapeutic option used in each case. Polymorphism were detected by PCR-RFLP. Survival curves were analysed according to the Kaplan-Meier model and its significance confirmed by the p of Wilcoxcon, being the error margin set to less than 5%. Associations between polymorphisms and local disease relapse, death and disease-free survival were not statistically significant. In contrast, MTHFR C677T patients with larynx SCC treated with radiotherapy showed that when at least T allele is present, there is a 3x decrease in the chance of early death. Therefore, this polymorphism may be an important biomarker for the prognostic evalution of larynx SCC patients treated with radiotherapy.

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Orientadores : Telma Teixeira Franco, Ines Conceição Roberto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T12:46:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mayerhoff_ZeaDuqueVieiraLuna_D.pdf: 4590505 bytes, checksum: 842e0391400f99be260f73db7efc30c8 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A obtenção, extração e caracterização parcial da enzima xilose redutase (XR) presente no extrato celular da levedura Candida mogii NRRL Y-17032 cultivada em hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz foram estudadas neste trabalho. A concentração de hidrolisado no meio de cultivo para a produção da XR foi avaliada, e os maiores valores de produção e produtividade específica (35 U/g de célula e 0,97 U/[g de célula. h], respectivamente) foram obtidos em fermentações empregando meio contendo 49,2 g xilose/l. As condições para atividade ótima da XR in vitro foram estudadas e a máxima atividade volumétrica (0,54 U/ml) foi obtida empregando pH de 6,5 e 38°C. No estudo da estabilidade, a atividade da XR permaneceu constante por 3 horas às temperaturas de 4 e 38°C, e por 4 meses sob congelamento a -18 oCo Os parâmetros cinéticos determinados para a XR foram Vmax = 0,485 U/ml e Km = 63 mM para a xilose e Vmax = 0,390 U/ml e Km = 0,032 mM para o cofator NADPH. Para o rompimento celular de C. mogii por agitação com esferas de vidro, a maior atividade volumétrica (0,683 U/ml) foi encontrada empregando esferas de 300 µm de diâmetro, concentração celular de 45 g/l e 50 ciclos de agitação. No estudo para extração da XR em sistemas de duas fases aquosas, modelos matemáticos foram previstos para o fator de purificação e o percentual de recuperação (rendimento) na fase superior, e os valores máximos previstos por estes modelos foram 1,59 e 105,8, respectivamente / Abstract: The obtainment, extraction and partial characterization of the enzyme xylose reductase (XR) present in cell extract of the yeast Candida mogii NRRL Y-17032 cultivated in rice straw hemicellulosic hydrolysate were studied in this work. The XR production was evaluated by varying the concentration of hydrolysate in the growth medium, and the highest values of production and specific productivity (35 U/g of cell and 0.97 U/[g of cell.h], respectively) were obtained in fermentations employing medium containing 49.2 9 xylose/l. The conditions for in vitro optimal XR activity were studied and the maximum volumetric activity (0.54 U/ml) was obtained employing pH 6.5 and 38°C. In the study of the stability, XR activity remained constant for 3 hours at temperatures of 4 and 38°C, and for 4 months at -18°C. The kinetic parameters determined for XR were Vmax = 0.485 U/ml and Km = 63 mM for xylose and Vmax = 0.390 U/ml and Km = 0.032 mM for the cofactor NADPH. For the disruption of C. mogii cells by mechanical agitation with glass beads, the highest volumetric activity (0.683 U/ml) was found employing 300 µm diameter beads, cell concentration of 45 g/l and 50 cycles of agitation. In the study for XR extraction in aqueous two-phase systems, mathematical models were predicted for the purification factor and percent recovery (yield) on top phase, and the maximum values predicted by these models were 1.59 and 105.8, respectively / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP com Guzmania monostachia demonstraram que quando essas plantas são submetidas ao déficit hídrico ocorre a indução do CAM, com maior expressão desse metabolismo na porção foliar apical. Para outra espécie (Vriesea gigantea), foi verificada a maior atividade da enzima nitrato redutase (NR) na porção basal durante o período diurno. Em uma bromélia terrestre (Ananas comosus) foi observada a sinalização por citocininas tanto na indução da expressão gênica, quanto na ativação da NR. Outros laboratórios evidenciaram que plantas de Mesembryanthemum crystallinum induzidas ao CAM apresentaram uma provável regulação negativa da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) por citocininas. Em decorrência desses conhecimentos acumulados, surgiram novos questionamentos: haveria variações diuturnas da atividade das enzimas PEPC e NR nas diferentes porções das folhas de G. monostachia induzidas ao CAM? A maior disponibilidade de esqueletos carbônicos à noite (acúmulo de acidez) influenciaria positivamente a atividade da NR, deslocando seu pico de atividade para o período noturno? As variações dos teores endógenos de citocininas acompanhariam as possíveis mudanças da atividade da PEPC e da NR, indicando, assim, a participação dessa classe hormonal na regulação dessas enzimas? O presente trabalho teve por objetivo principal investigar uma possível regulação da atividade das enzimas PEPC e NR por citocininas em folhas destacadas da bromélia epífita com tanque, Guzmania monostachia (Bromeliaceae) induzidas ao CAM. Foi esperado com esta pesquisa aprofundar os estudos sobre a inter-relação entre o comportamento fotossintético, a capacidade de assimilação de nitrogênio e a possível regulação das atividades da PEPC e da NR por citocininas endógenas. Análises de acidez titulável, ácidos orgânicos, amido endógeno e da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) foram realizadas, confirmando a indução do CAM nas folhas isoladas de G. monostachia mantidas em polietilenoglicol (PEG) a uma concentração de 30%. O uso desse composto foi eficiente na redução do conteúdo relativo de água e na imposição da deficiência hídrica foliar. Além disso, pôde-se verificar a maior expressão do CAM na porção apical das folhas mantidas em PEG 30%, quando comparada à porção basal. Análises da atividade da PEPC e da NR permitiram verificar a separação espacial dessas enzimas. A primeira apresentou maior atividade no ápice foliar, enquanto a segunda mostrou a maior atividade na porção basal. Apesar disso, não foi observada a separação temporal dessas enzimas, uma vez que ambas apresentaram picos de atividade noturna. A maior atividade da NR durante o período escuro (01 hora) foi verificada nas folhas-controle ou sob deficiência hídrica. Esse resultado sugere que outros fatores, diferentes do metabolismo CAM, influenciaram para a ocorrência da maior atividade dessa enzima durante o período noturno. Os resultados obtidos ainda sugerem que as citocininas possivelmente atuaram como um regulador negativo para a atividade da PEPC durante o dia, uma vez que os maiores níveis endógenos desse hormônio foram observados durante esse período, enquanto a maior atividade dessa enzima foi verificada durante a noite, quando os teores de Z+iP decaíram significativamente. A aplicação de Z ou iP resultou também num decréscimo da atividade dessa enzima. Por outro lado, as citocininas atuaram como um provável regulador positivo para a atividade da NR, uma vez que a maior atividade noturna dessa enzima foi antecedida em 3 ou 6 horas pelos maiores níveis endógenos de citocininas na porção basal das folhas mantidas em água ou PEG 30%, respectivamente. A aplicação de citocininas-livres aumentou significativamente a atividade da NR na base das folhas destacadas mantidas em água ou PEG 30% / Prior studies undertaken in the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP with Guzmania monostachia have shown that during water shortage, CAM induction occurs with greater expression in the apical portion of the leaf. In the case of another species (Vriesea gigantean), more intense nitrate reductase (NR) enzyme activity was observed in the basal portion during the daytime. In a certain terrestrial bromeliad (Ananas comosus), signaling by cytokinins, both in the induction of gene expression as well as NR activation, was observed. According to other laboratories, the cytokinins seem to play a negative regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in CAM induced Mesembryanthemum crystallinum plants. As a result of accumulated knowledge, new questions have arisen, such as: Are there daily variations in PEPC and NR enzymes activity in the different portions of CAM induced leaves of G. monostachia? Would the more pronounced nocturnal availability of carbon skeletons (accumulation of acidity) positively influence NR activity, with consequential displacement of its peak of activity to this period? Would variations in endogenous cytokinins concentration accompany possible changes in PEPC and NR activity, thereby indicating the participation of this hormonal class in their regulation? The main aim in the present study was to investigate the possible regulation of PEPC and NR activity by cytokinins in detached CAM-induced leaves of the epiphyte tank bromeliad Guzmania monostachia (Bromeliaceae). The expectations with this research were to study more deeply the inter-relationship between photosynthetic behavior, the capacity for nitrogen assimilation and the possible regulation of PEPC and NR activity by endogenous cytokinins. Analyses of titratable acidity, organic acids, endogenous starch and malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity confirmed CAM induction in isolated leaves of G. monostachia kept in polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 30%. The use of this compound was efficient in reducing relative water content and imposing leaf water deficiency. Furthermore, compared to the basal portion, greater CAM expression could be observed in the apical portion of leaves kept in PEG 30%. Analyses of PEPC and NR activity allowed detecting their mutual spatial separation, seeing that, in the first greater activity was concentrated in the leaf apex, while in the second this was more pronounced in the basal portion. Even so, no temporal separation could be observed, since peak of activity for both occurred at night. The peak of nocturnal NR activity (1 hour) was observed in control leaves or those undergoing water deficiency, thereby implying that factors, other than CAM metabolism, exerted an influence on the occurrence of more intense activity of this enzyme at this time. Furthermore, there were indications that cytokinins possibly act as a negative regulator of PEPC activity during the daytime, when the highest endogenous levels of this hormone were observed, whereas it was apparent that the most intense activity of this enzyme actually occurred at night, when Z+iP rates decreased significantly. Z or iP application also induced a decrease in the activity of this enzyme. On the other hand, the cytokinins acted as a positive regulator of NR activity, since the nocturnal peak of activity of this enzyme was preceded by 3 or 6 hours by higher endogenous levels of cytokinins in the basal portion of leaves maintained in water or PEG 30%, respectively. The application of free cytokinins induced a significant increase in NR activity in the base of detached leaves kept in water or PEG 30%

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP com Guzmania monostachia demonstraram que quando essas plantas são submetidas ao déficit hídrico ocorre a indução do CAM, com maior expressão desse metabolismo na porção foliar apical. Para outra espécie (Vriesea gigantea), foi verificada a maior atividade da enzima nitrato redutase (NR) na porção basal durante o período diurno. Em uma bromélia terrestre (Ananas comosus) foi observada a sinalização por citocininas tanto na indução da expressão gênica, quanto na ativação da NR. Outros laboratórios evidenciaram que plantas de Mesembryanthemum crystallinum induzidas ao CAM apresentaram uma provável regulação negativa da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) por citocininas. Em decorrência desses conhecimentos acumulados, surgiram novos questionamentos: haveria variações diuturnas da atividade das enzimas PEPC e NR nas diferentes porções das folhas de G. monostachia induzidas ao CAM? A maior disponibilidade de esqueletos carbônicos à noite (acúmulo de acidez) influenciaria positivamente a atividade da NR, deslocando seu pico de atividade para o período noturno? As variações dos teores endógenos de citocininas acompanhariam as possíveis mudanças da atividade da PEPC e da NR, indicando, assim, a participação dessa classe hormonal na regulação dessas enzimas? O presente trabalho teve por objetivo principal investigar uma possível regulação da atividade das enzimas PEPC e NR por citocininas em folhas destacadas da bromélia epífita com tanque, Guzmania monostachia (Bromeliaceae) induzidas ao CAM. Foi esperado com esta pesquisa aprofundar os estudos sobre a inter-relação entre o comportamento fotossintético, a capacidade de assimilação de nitrogênio e a possível regulação das atividades da PEPC e da NR por citocininas endógenas. Análises de acidez titulável, ácidos orgânicos, amido endógeno e da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) foram realizadas, confirmando a indução do CAM nas folhas isoladas de G. monostachia mantidas em polietilenoglicol (PEG) a uma concentração de 30%. O uso desse composto foi eficiente na redução do conteúdo relativo de água e na imposição da deficiência hídrica foliar. Além disso, pôde-se verificar a maior expressão do CAM na porção apical das folhas mantidas em PEG 30%, quando comparada à porção basal. Análises da atividade da PEPC e da NR permitiram verificar a separação espacial dessas enzimas. A primeira apresentou maior atividade no ápice foliar, enquanto a segunda mostrou a maior atividade na porção basal. Apesar disso, não foi observada a separação temporal dessas enzimas, uma vez que ambas apresentaram picos de atividade noturna. A maior atividade da NR durante o período escuro (01 hora) foi verificada nas folhas-controle ou sob deficiência hídrica. Esse resultado sugere que outros fatores, diferentes do metabolismo CAM, influenciaram para a ocorrência da maior atividade dessa enzima durante o período noturno. Os resultados obtidos ainda sugerem que as citocininas possivelmente atuaram como um regulador negativo para a atividade da PEPC durante o dia, uma vez que os maiores níveis endógenos desse hormônio foram observados durante esse período, enquanto a maior atividade dessa enzima foi verificada durante a noite, quando os teores de Z+iP decaíram significativamente. A aplicação de Z ou iP resultou também num decréscimo da atividade dessa enzima. Por outro lado, as citocininas atuaram como um provável regulador positivo para a atividade da NR, uma vez que a maior atividade noturna dessa enzima foi antecedida em 3 ou 6 horas pelos maiores níveis endógenos de citocininas na porção basal das folhas mantidas em água ou PEG 30%, respectivamente. A aplicação de citocininas-livres aumentou significativamente a atividade da NR na base das folhas destacadas mantidas em água ou PEG 30% / Prior studies undertaken in the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP with Guzmania monostachia have shown that during water shortage, CAM induction occurs with greater expression in the apical portion of the leaf. In the case of another species (Vriesea gigantean), more intense nitrate reductase (NR) enzyme activity was observed in the basal portion during the daytime. In a certain terrestrial bromeliad (Ananas comosus), signaling by cytokinins, both in the induction of gene expression as well as NR activation, was observed. According to other laboratories, the cytokinins seem to play a negative regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in CAM induced Mesembryanthemum crystallinum plants. As a result of accumulated knowledge, new questions have arisen, such as: Are there daily variations in PEPC and NR enzymes activity in the different portions of CAM induced leaves of G. monostachia? Would the more pronounced nocturnal availability of carbon skeletons (accumulation of acidity) positively influence NR activity, with consequential displacement of its peak of activity to this period? Would variations in endogenous cytokinins concentration accompany possible changes in PEPC and NR activity, thereby indicating the participation of this hormonal class in their regulation? The main aim in the present study was to investigate the possible regulation of PEPC and NR activity by cytokinins in detached CAM-induced leaves of the epiphyte tank bromeliad Guzmania monostachia (Bromeliaceae). The expectations with this research were to study more deeply the inter-relationship between photosynthetic behavior, the capacity for nitrogen assimilation and the possible regulation of PEPC and NR activity by endogenous cytokinins. Analyses of titratable acidity, organic acids, endogenous starch and malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity confirmed CAM induction in isolated leaves of G. monostachia kept in polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 30%. The use of this compound was efficient in reducing relative water content and imposing leaf water deficiency. Furthermore, compared to the basal portion, greater CAM expression could be observed in the apical portion of leaves kept in PEG 30%. Analyses of PEPC and NR activity allowed detecting their mutual spatial separation, seeing that, in the first greater activity was concentrated in the leaf apex, while in the second this was more pronounced in the basal portion. Even so, no temporal separation could be observed, since peak of activity for both occurred at night. The peak of nocturnal NR activity (1 hour) was observed in control leaves or those undergoing water deficiency, thereby implying that factors, other than CAM metabolism, exerted an influence on the occurrence of more intense activity of this enzyme at this time. Furthermore, there were indications that cytokinins possibly act as a negative regulator of PEPC activity during the daytime, when the highest endogenous levels of this hormone were observed, whereas it was apparent that the most intense activity of this enzyme actually occurred at night, when Z+iP rates decreased significantly. Z or iP application also induced a decrease in the activity of this enzyme. On the other hand, the cytokinins acted as a positive regulator of NR activity, since the nocturnal peak of activity of this enzyme was preceded by 3 or 6 hours by higher endogenous levels of cytokinins in the basal portion of leaves maintained in water or PEG 30%, respectively. The application of free cytokinins induced a significant increase in NR activity in the base of detached leaves kept in water or PEG 30%