Estudos anteriores realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP com Guzmania monostachia demonstraram que quando essas plantas são submetidas ao déficit hídrico ocorre a indução do CAM, com maior expressão desse metabolismo na porção foliar apical. Para outra espécie (Vriesea gigantea), foi verificada a maior atividade da enzima nitrato redutase (NR) na porção basal durante o período diurno. Em uma bromélia terrestre (Ananas comosus) foi observada a sinalização por citocininas tanto na indução da expressão gênica, quanto na ativação da NR. Outros laboratórios evidenciaram que plantas de Mesembryanthemum crystallinum induzidas ao CAM apresentaram uma provável regulação negativa da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) por citocininas. Em decorrência desses conhecimentos acumulados, surgiram novos questionamentos: haveria variações diuturnas da atividade das enzimas PEPC e NR nas diferentes porções das folhas de G. monostachia induzidas ao CAM? A maior disponibilidade de esqueletos carbônicos à noite (acúmulo de acidez) influenciaria positivamente a atividade da NR, deslocando seu pico de atividade para o período noturno? As variações dos teores endógenos de citocininas acompanhariam as possíveis mudanças da atividade da PEPC e da NR, indicando, assim, a participação dessa classe hormonal na regulação dessas enzimas? O presente trabalho teve por objetivo principal investigar uma possível regulação da atividade das enzimas PEPC e NR por citocininas em folhas destacadas da bromélia epífita com tanque, Guzmania monostachia (Bromeliaceae) induzidas ao CAM. Foi esperado com esta pesquisa aprofundar os estudos sobre a inter-relação entre o comportamento fotossintético, a capacidade de assimilação de nitrogênio e a possível regulação das atividades da PEPC e da NR por citocininas endógenas. Análises de acidez titulável, ácidos orgânicos, amido endógeno e da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) foram realizadas, confirmando a indução do CAM nas folhas isoladas de G. monostachia mantidas em polietilenoglicol (PEG) a uma concentração de 30%. O uso desse composto foi eficiente na redução do conteúdo relativo de água e na imposição da deficiência hídrica foliar. Além disso, pôde-se verificar a maior expressão do CAM na porção apical das folhas mantidas em PEG 30%, quando comparada à porção basal. Análises da atividade da PEPC e da NR permitiram verificar a separação espacial dessas enzimas. A primeira apresentou maior atividade no ápice foliar, enquanto a segunda mostrou a maior atividade na porção basal. Apesar disso, não foi observada a separação temporal dessas enzimas, uma vez que ambas apresentaram picos de atividade noturna. A maior atividade da NR durante o período escuro (01 hora) foi verificada nas folhas-controle ou sob deficiência hídrica. Esse resultado sugere que outros fatores, diferentes do metabolismo CAM, influenciaram para a ocorrência da maior atividade dessa enzima durante o período noturno. Os resultados obtidos ainda sugerem que as citocininas possivelmente atuaram como um regulador negativo para a atividade da PEPC durante o dia, uma vez que os maiores níveis endógenos desse hormônio foram observados durante esse período, enquanto a maior atividade dessa enzima foi verificada durante a noite, quando os teores de Z+iP decaíram significativamente. A aplicação de Z ou iP resultou também num decréscimo da atividade dessa enzima. Por outro lado, as citocininas atuaram como um provável regulador positivo para a atividade da NR, uma vez que a maior atividade noturna dessa enzima foi antecedida em 3 ou 6 horas pelos maiores níveis endógenos de citocininas na porção basal das folhas mantidas em água ou PEG 30%, respectivamente. A aplicação de citocininas-livres aumentou significativamente a atividade da NR na base das folhas destacadas mantidas em água ou PEG 30% / Prior studies undertaken in the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP with Guzmania monostachia have shown that during water shortage, CAM induction occurs with greater expression in the apical portion of the leaf. In the case of another species (Vriesea gigantean), more intense nitrate reductase (NR) enzyme activity was observed in the basal portion during the daytime. In a certain terrestrial bromeliad (Ananas comosus), signaling by cytokinins, both in the induction of gene expression as well as NR activation, was observed. According to other laboratories, the cytokinins seem to play a negative regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in CAM induced Mesembryanthemum crystallinum plants. As a result of accumulated knowledge, new questions have arisen, such as: Are there daily variations in PEPC and NR enzymes activity in the different portions of CAM induced leaves of G. monostachia? Would the more pronounced nocturnal availability of carbon skeletons (accumulation of acidity) positively influence NR activity, with consequential displacement of its peak of activity to this period? Would variations in endogenous cytokinins concentration accompany possible changes in PEPC and NR activity, thereby indicating the participation of this hormonal class in their regulation? The main aim in the present study was to investigate the possible regulation of PEPC and NR activity by cytokinins in detached CAM-induced leaves of the epiphyte tank bromeliad Guzmania monostachia (Bromeliaceae). The expectations with this research were to study more deeply the inter-relationship between photosynthetic behavior, the capacity for nitrogen assimilation and the possible regulation of PEPC and NR activity by endogenous cytokinins. Analyses of titratable acidity, organic acids, endogenous starch and malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity confirmed CAM induction in isolated leaves of G. monostachia kept in polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 30%. The use of this compound was efficient in reducing relative water content and imposing leaf water deficiency. Furthermore, compared to the basal portion, greater CAM expression could be observed in the apical portion of leaves kept in PEG 30%. Analyses of PEPC and NR activity allowed detecting their mutual spatial separation, seeing that, in the first greater activity was concentrated in the leaf apex, while in the second this was more pronounced in the basal portion. Even so, no temporal separation could be observed, since peak of activity for both occurred at night. The peak of nocturnal NR activity (1 hour) was observed in control leaves or those undergoing water deficiency, thereby implying that factors, other than CAM metabolism, exerted an influence on the occurrence of more intense activity of this enzyme at this time. Furthermore, there were indications that cytokinins possibly act as a negative regulator of PEPC activity during the daytime, when the highest endogenous levels of this hormone were observed, whereas it was apparent that the most intense activity of this enzyme actually occurred at night, when Z+iP rates decreased significantly. Z or iP application also induced a decrease in the activity of this enzyme. On the other hand, the cytokinins acted as a positive regulator of NR activity, since the nocturnal peak of activity of this enzyme was preceded by 3 or 6 hours by higher endogenous levels of cytokinins in the basal portion of leaves maintained in water or PEG 30%, respectively. The application of free cytokinins induced a significant increase in NR activity in the base of detached leaves kept in water or PEG 30%

Ao longo dos últimos anos, o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) tem sido bem estudado em espécies das famílias Bromeliaceae e, principalmente, Crassulaceae. Essa via fotossintética é caracterizada pelo acúmulo noturno de ácidos orgânicos dentro do vacúolo e pela fixação de CO2 durante a noite pela enzima fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC). No entanto, pouco se sabe sobre a preferência pela atividade da enzima ATPase ou PPiase no transporte de prótons e ácidos orgânicos no interior das vesículas do tonoplasto em espécies CAM. A fotossíntese CAM pode ser induzida em plantas caracterizadas como CAM-facultativas por diversos fatores ambientais, por exemplo, déficit hídrico, termoperíodo, salinidade e deficiência de nutrientes. Contudo, pouco tem sido discutido sobre a influência dos nutrientes na indução do CAM. Esse estudo investigou o transporte de prótons através da membrana do tonoplasto em seis espécies de bromélias CAM e duas espécies de Kalanchoë. Todas as espécies usadas nesse estudo mostrou uma preferência pela ATPase do que pela PPiase para o transporte de prótons e ácidos orgânicos no interior das vesículas do tonoplasto. Nós também observamos uma maior expressão do CAM nas plantas de Kalanchoë laxiflora e Kalanchoë tubiflora mantidas na presença de 2.5 mM de NO3-. Por outro lado, Guzmania monostachia, uma espécie de bromélia epífita, exibiu a maior intensidade do CAM nas folhas mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico. Nessa espécie de bromélia, a maior expressão do gene ALMT9 na porção apical das folhas, seguido pelas maiores taxas de transporte de prótons pela ATPase, acúmulo de açucares solúveis e a ativação das defesas antioxidantes parecem estar relacionados com o aumento da tolerância pelo ajuste osmótico e limitação do dano oxidativo nas folhas mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico. Uma outra explicação para a maior intensidade do CAM no ápice das folhas mantidas em NH4+ + déficit hídrico poderia ser a maior expressão dos genes que codificam aquaporinas, principalmente GmPIPs e GmTIPs, que talvez sejam responsáveis pelo transporte de água das porções basal e mediana para a porção apical das folhas. O maior conteúdo de água conservado na porção apical poderia ajudar a aumentar a intensidade da fotossíntese CAM nessa porção das folhas de G. monostachia mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico / Historically, crassulacean acid metabolism (CAM) has been studied in many families, mainly Bromeliaceae and Crassulaceae. This photosynthetic pathway is characterized by the nocturnal organic acid accumulation in the vacuole as well as CO2 fixation during the night by the phosphoenolpyruvate carboxylase enzyme (PEPC). However, little is known about the preference of ATPase or PPiase activities for the proton and organic acids transport in tonoplast vesicles in CAM species. CAM photosynthesis can be inducted in CAM-facultative species by environmental factors such as, water deficit, thermoperiod, salinity and nutrients deficiency. Although, little has been discussed about the influence of nutrients on CAM induction. This study investigated proton transport in CAM bromeliad species and two CAM Kalanchoë species. All of the species used in this study showed a preference for ATPase rather than PPiase for the proton and organic acids transport into the tonoplast vesicles. We also observed a higher CAM expression in Kalanchoë laxiflora and Kalanchoë tubiflora plants kept in the presence of 2.5 mM of NO3-. On the other hand, Guzmania monostachia plants, an epiphytic tank bromeliad species, exhibited the highest CAM intensity in the leaves kept in the presence of NH4+ + water deficit. In this same bromeliad, a malate transporter gene, ALMT9, showed its highest expression in the apical portion of the leaves and the highest proton transport rates into the vacuole by ATPase. Soluble sugars and antioxidant enzymes activities were also verified in this study in order to observe their influence on increasing the drought tolerance of G. monostachia. In the leaves kept in NH4+ + water deficit the highest antioxidant activities and accumulation of soluble sugars were observed, this suggests that this inorganic nitrogen source seems to increase the drought tolerance by osmotic adjustment and limitation of oxidative damage. These factors can favor the increase of CAM intensity in the leaves kept under NH4+ + water deficiency. Another explanation for why the highest CAM intensity was observed in the apical portion of the leaves kept in NH4+ + water deficiency is because of the higher expression of aquaporin genes in the basal and middle regions of the leaves in the presence of this N source, mainly GmPIP and GmTIP, which might be responsible for transporting water from the basal and middle portions to the apical portion where these AQP genes are repressed. The fact that the highest water content is conserved in the apical portion might help to explain the increase in the intensity of CAM photosynthesis observed in the leaves of G. monostachia kept in the presence of NH4+ + water deficit

A expressão do metabolismo ácido crassuláceo (CAM) nas plantas C3-CAM facultativas pode ser fortemente modulada por uma variedade de sinais ambientais e endógenos. Visto que plantas de abacaxizeiro (Ananas comosus, variedade Smooth Cayenne) podem apresentar comportamento fotossintético do tipo C3 ou CAM quando cultivadas in vitro, o presente trabalho buscou analisar a participação de quatro classes hormonais (ácido abscísico, citocininas, auxinas e etileno), do cálcio citossólico (Ca2+cit.) e do óxido nítrico (NO) na regulação da expressão do CAM nessa bromélia. Para tanto, os teores endógenos desses sinalizadores foram quantificados durante a indução e a reversão do CAM em abacaxizeiro. Além disso, também foram realizadas análises do grau de expressão do CAM em plantas tratadas com esses compostos sinalizadores ou com seus inibidores de síntese, transporte ou percepção. Os dados obtidos evidenciaram uma correlação positiva entre os teores endógenos de ácido abscísico (ABA) e a expressão do CAM em abacaxizeiro, uma vez que a indução e a reversão do CAM foram acompanhadas de, respectivamente, aumentos e reduções no conteúdo foliar desse hormônio. Em consonância com esses resultados, o fornecimento de ABA exógeno resultou na indução do CAM em plantas mantidas na ausência de estresse hídrico, indicando, portanto, um efeito estimulatório desse hormônio sobre a expressão do CAM em A. comosus.Entretanto, constatou-se que a inibição do acúmulo de ABA não afetou a indução do CAM em resposta ao estresse hídrico, sugerindo que a transição de C3 para CAM em abacaxizeiro pode ocorrer tanto por uma via de sinalização dependente de ABA quanto por uma via independente de ABA. De modo inverso, os dados indicaram que as citocininas atuariam como reguladoras negativas da expressão do CAM em abacaxizeiro, uma vez que a aplicação desse hormônio inibiu parcialmente a indução do CAM em resposta ao estresse hídrico e, além disso, o conteúdo endógeno das quatro citocininas analisadas foi inversamente proporcional ao grau de expressão do CAM nessa bromélia. As auxinas e o etileno, por sua vez, parecem não estar envolvidos na regulação dos processos de indução e de reversão do CAM em abacaxizeiro. Por outro lado, os dados obtidos indicaram, de forma inédita, um papel sinalizador positivo do NO sobre a expressão da fotossíntese CAM. Verificou-se, por exemplo, que a aplicação de NO exógeno promoveu um aumento considerável na expressão do CAM em plantas de abacaxizeiro e, de modo condizente, foi observado um incremento na produção desse radical livre durante a transição da fotossíntese C3 para CAM em resposta ao estresse hídrico. Além disso, foi interessante constatar que a elevação na síntese de NO nos tecidos foliares de abacaxizeiro ocorreu principalmente no parênquima clorofiliano, sendo este tecido um dos principais alvos das alterações metabólicas necessárias para o estabelecimento da fotossíntese CAM. Os resultados também sugerem que o NO atuaria como um mensageiro secundário do sinal do ABA na indução do CAM, já que a produção desse radical livre aumentou consideravelmente nas plantas tratadas com ABA e, em paralelo, tratamentos com seqüestrador de NO bloquearam parcialmente a indução do CAM em resposta ao ABA. Por fim, os tratamentos com quelante ou ionóforo de cálcio evidenciaram que o aumento na concentração citoplasmática desse íon desempenha uma função crucial na regulação da indução de A. comosus ao CAM em resposta ao estresse hídrico. De acordo com os resultados, alterações na concentração Ca2+ citossólico parecem representar um ponto de convergência entre as vias de sinalização dependente e independente de ABA que levam à indução do CAM em abacaxizeiro. Em conjunto, os dados obtidos no presente trabalho indicam que o ABA, o NO e o Ca2+ citossólico interagem durante os eventos que sinalização que resultam na transição de C3 para CAM em abacaxizeiro, enquanto que as citocininas parecem reprimir a expressão da fotossíntese CAM. / The Crassulacean acid metabolism (CAM) expression in C3-CAM facultative plants can be strongly modulated by a diversity of environmental and endogenous signals. Since pineapple (Ananas comosus, variety Smooth Cayenne) plants can perform either C3 or CAM photosynthesis when grown in vitro, this work attempted to investigate the involvement of four hormonal classes (abscisic acid, cytokinins, auxins and ethylene), cytosolic calcium (Ca2+cit.) and nitric oxide (NO) on the regulation of CAM expression in this bromeliad. To achieve this, the levels of these signaling compounds were measured during the pineapple C3-to-CAM induction and the CAM-to-C3 reversion. Furthermore, the degree of CAM expression in plants treated with these compounds and their inhibitors of synthesis, transport or perception was also analyzed. The data obtained showed that the endogenous levels of ABA were positively correlated with the degree of CAM expression in pineapple, since the C3-to-CAM transition and the CAM-to-C3 reversion in this bromeliad were preceded by, respectively, increases and decreases in the ABA leaf content. Consistent with these results; exogenously applied ABA increased the CAM expression in plants maintained in the absence of water stress, thus, indicating a stimulatory effect of this hormone on the A. comosus CAM expression. However, the inhibition of ABA accumulation did not affect the CAM induction by water stress, suggesting that the pineapple C3-to-CAM transition can occur via both ABA-dependent and ABA-independent signaling pathways. On the opposite, the data indicated that cytokinins act as negative regulators of CAM expression in pineapple, since the adding of this hormone partially inhibited the CAM induction by water stress and, additionally, the endogenous levels of the four cytokinins analyzed were inversely proportional to the degree of CAM expression in this bromeliad. Auxins and ethylene, conversely, seem not to be involved in the regulation of the C3-to-CAM transition and the CAM-to-C3 reversion in pineapple. On the other hand, the data obtained indicated, by the first time, a positive signaling role for the NO on the expression of CAM photosynthesis. For instance, it was observed that the exogenously applied NO increased the CAM expression in pineapple plants and, in agreement; there was an elevation in the production of this free radical during the water stress-induced C3-to-CAM transition. Additionally, the elevation of the NO synthesis in the pineapple leaf tissues occurred mainly in the chlorenchyma, which is the plant tissue responsible for most of the metabolic changes necessary to the CAM photosynthesis establishment. The results also suggested that the NO may act as a second messenger of the ABA signal in the pineapple CAM induction, since the production of this free radical in ABA-treated plants increased considerably and, in parallel, treatments with a NO scavenger partially blocked the ABA-induced C3-to-CAM transition. Finally, treatments with calcium chelator or ionophore indicated that the increase in the cytosolic concentration of this ion plays a crucial role in the regulation of the CAM induction by water stress in A. comosus.According to the results, changes in the concentration of Ca2+ cytosolic seem to represent a convergence point between the ABA-dependent and ABA-independent signaling cascade leading to CAM induction in pineapple. Taken together, the data obtained in the present work indicated that ABA, NO and cytosolic Ca2+ interact during the signaling events leading to the pineapple C3-CAM transition, while the cytokinins seem to repress the expression of CAM photosynthesis.

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP com Guzmania monostachia demonstraram que quando essas plantas são submetidas ao déficit hídrico ocorre a indução do CAM, com maior expressão desse metabolismo na porção foliar apical. Para outra espécie (Vriesea gigantea), foi verificada a maior atividade da enzima nitrato redutase (NR) na porção basal durante o período diurno. Em uma bromélia terrestre (Ananas comosus) foi observada a sinalização por citocininas tanto na indução da expressão gênica, quanto na ativação da NR. Outros laboratórios evidenciaram que plantas de Mesembryanthemum crystallinum induzidas ao CAM apresentaram uma provável regulação negativa da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) por citocininas. Em decorrência desses conhecimentos acumulados, surgiram novos questionamentos: haveria variações diuturnas da atividade das enzimas PEPC e NR nas diferentes porções das folhas de G. monostachia induzidas ao CAM? A maior disponibilidade de esqueletos carbônicos à noite (acúmulo de acidez) influenciaria positivamente a atividade da NR, deslocando seu pico de atividade para o período noturno? As variações dos teores endógenos de citocininas acompanhariam as possíveis mudanças da atividade da PEPC e da NR, indicando, assim, a participação dessa classe hormonal na regulação dessas enzimas? O presente trabalho teve por objetivo principal investigar uma possível regulação da atividade das enzimas PEPC e NR por citocininas em folhas destacadas da bromélia epífita com tanque, Guzmania monostachia (Bromeliaceae) induzidas ao CAM. Foi esperado com esta pesquisa aprofundar os estudos sobre a inter-relação entre o comportamento fotossintético, a capacidade de assimilação de nitrogênio e a possível regulação das atividades da PEPC e da NR por citocininas endógenas. Análises de acidez titulável, ácidos orgânicos, amido endógeno e da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) foram realizadas, confirmando a indução do CAM nas folhas isoladas de G. monostachia mantidas em polietilenoglicol (PEG) a uma concentração de 30%. O uso desse composto foi eficiente na redução do conteúdo relativo de água e na imposição da deficiência hídrica foliar. Além disso, pôde-se verificar a maior expressão do CAM na porção apical das folhas mantidas em PEG 30%, quando comparada à porção basal. Análises da atividade da PEPC e da NR permitiram verificar a separação espacial dessas enzimas. A primeira apresentou maior atividade no ápice foliar, enquanto a segunda mostrou a maior atividade na porção basal. Apesar disso, não foi observada a separação temporal dessas enzimas, uma vez que ambas apresentaram picos de atividade noturna. A maior atividade da NR durante o período escuro (01 hora) foi verificada nas folhas-controle ou sob deficiência hídrica. Esse resultado sugere que outros fatores, diferentes do metabolismo CAM, influenciaram para a ocorrência da maior atividade dessa enzima durante o período noturno. Os resultados obtidos ainda sugerem que as citocininas possivelmente atuaram como um regulador negativo para a atividade da PEPC durante o dia, uma vez que os maiores níveis endógenos desse hormônio foram observados durante esse período, enquanto a maior atividade dessa enzima foi verificada durante a noite, quando os teores de Z+iP decaíram significativamente. A aplicação de Z ou iP resultou também num decréscimo da atividade dessa enzima. Por outro lado, as citocininas atuaram como um provável regulador positivo para a atividade da NR, uma vez que a maior atividade noturna dessa enzima foi antecedida em 3 ou 6 horas pelos maiores níveis endógenos de citocininas na porção basal das folhas mantidas em água ou PEG 30%, respectivamente. A aplicação de citocininas-livres aumentou significativamente a atividade da NR na base das folhas destacadas mantidas em água ou PEG 30% / Prior studies undertaken in the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP with Guzmania monostachia have shown that during water shortage, CAM induction occurs with greater expression in the apical portion of the leaf. In the case of another species (Vriesea gigantean), more intense nitrate reductase (NR) enzyme activity was observed in the basal portion during the daytime. In a certain terrestrial bromeliad (Ananas comosus), signaling by cytokinins, both in the induction of gene expression as well as NR activation, was observed. According to other laboratories, the cytokinins seem to play a negative regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in CAM induced Mesembryanthemum crystallinum plants. As a result of accumulated knowledge, new questions have arisen, such as: Are there daily variations in PEPC and NR enzymes activity in the different portions of CAM induced leaves of G. monostachia? Would the more pronounced nocturnal availability of carbon skeletons (accumulation of acidity) positively influence NR activity, with consequential displacement of its peak of activity to this period? Would variations in endogenous cytokinins concentration accompany possible changes in PEPC and NR activity, thereby indicating the participation of this hormonal class in their regulation? The main aim in the present study was to investigate the possible regulation of PEPC and NR activity by cytokinins in detached CAM-induced leaves of the epiphyte tank bromeliad Guzmania monostachia (Bromeliaceae). The expectations with this research were to study more deeply the inter-relationship between photosynthetic behavior, the capacity for nitrogen assimilation and the possible regulation of PEPC and NR activity by endogenous cytokinins. Analyses of titratable acidity, organic acids, endogenous starch and malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity confirmed CAM induction in isolated leaves of G. monostachia kept in polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 30%. The use of this compound was efficient in reducing relative water content and imposing leaf water deficiency. Furthermore, compared to the basal portion, greater CAM expression could be observed in the apical portion of leaves kept in PEG 30%. Analyses of PEPC and NR activity allowed detecting their mutual spatial separation, seeing that, in the first greater activity was concentrated in the leaf apex, while in the second this was more pronounced in the basal portion. Even so, no temporal separation could be observed, since peak of activity for both occurred at night. The peak of nocturnal NR activity (1 hour) was observed in control leaves or those undergoing water deficiency, thereby implying that factors, other than CAM metabolism, exerted an influence on the occurrence of more intense activity of this enzyme at this time. Furthermore, there were indications that cytokinins possibly act as a negative regulator of PEPC activity during the daytime, when the highest endogenous levels of this hormone were observed, whereas it was apparent that the most intense activity of this enzyme actually occurred at night, when Z+iP rates decreased significantly. Z or iP application also induced a decrease in the activity of this enzyme. On the other hand, the cytokinins acted as a positive regulator of NR activity, since the nocturnal peak of activity of this enzyme was preceded by 3 or 6 hours by higher endogenous levels of cytokinins in the basal portion of leaves maintained in water or PEG 30%, respectively. The application of free cytokinins induced a significant increase in NR activity in the base of detached leaves kept in water or PEG 30%

A expressão do metabolismo ácido crassuláceo (CAM) nas plantas C3-CAM facultativas pode ser fortemente modulada por uma variedade de sinais ambientais e endógenos. Visto que plantas de abacaxizeiro (Ananas comosus, variedade Smooth Cayenne) podem apresentar comportamento fotossintético do tipo C3 ou CAM quando cultivadas in vitro, o presente trabalho buscou analisar a participação de quatro classes hormonais (ácido abscísico, citocininas, auxinas e etileno), do cálcio citossólico (Ca2+cit.) e do óxido nítrico (NO) na regulação da expressão do CAM nessa bromélia. Para tanto, os teores endógenos desses sinalizadores foram quantificados durante a indução e a reversão do CAM em abacaxizeiro. Além disso, também foram realizadas análises do grau de expressão do CAM em plantas tratadas com esses compostos sinalizadores ou com seus inibidores de síntese, transporte ou percepção. Os dados obtidos evidenciaram uma correlação positiva entre os teores endógenos de ácido abscísico (ABA) e a expressão do CAM em abacaxizeiro, uma vez que a indução e a reversão do CAM foram acompanhadas de, respectivamente, aumentos e reduções no conteúdo foliar desse hormônio. Em consonância com esses resultados, o fornecimento de ABA exógeno resultou na indução do CAM em plantas mantidas na ausência de estresse hídrico, indicando, portanto, um efeito estimulatório desse hormônio sobre a expressão do CAM em A. comosus.Entretanto, constatou-se que a inibição do acúmulo de ABA não afetou a indução do CAM em resposta ao estresse hídrico, sugerindo que a transição de C3 para CAM em abacaxizeiro pode ocorrer tanto por uma via de sinalização dependente de ABA quanto por uma via independente de ABA. De modo inverso, os dados indicaram que as citocininas atuariam como reguladoras negativas da expressão do CAM em abacaxizeiro, uma vez que a aplicação desse hormônio inibiu parcialmente a indução do CAM em resposta ao estresse hídrico e, além disso, o conteúdo endógeno das quatro citocininas analisadas foi inversamente proporcional ao grau de expressão do CAM nessa bromélia. As auxinas e o etileno, por sua vez, parecem não estar envolvidos na regulação dos processos de indução e de reversão do CAM em abacaxizeiro. Por outro lado, os dados obtidos indicaram, de forma inédita, um papel sinalizador positivo do NO sobre a expressão da fotossíntese CAM. Verificou-se, por exemplo, que a aplicação de NO exógeno promoveu um aumento considerável na expressão do CAM em plantas de abacaxizeiro e, de modo condizente, foi observado um incremento na produção desse radical livre durante a transição da fotossíntese C3 para CAM em resposta ao estresse hídrico. Além disso, foi interessante constatar que a elevação na síntese de NO nos tecidos foliares de abacaxizeiro ocorreu principalmente no parênquima clorofiliano, sendo este tecido um dos principais alvos das alterações metabólicas necessárias para o estabelecimento da fotossíntese CAM. Os resultados também sugerem que o NO atuaria como um mensageiro secundário do sinal do ABA na indução do CAM, já que a produção desse radical livre aumentou consideravelmente nas plantas tratadas com ABA e, em paralelo, tratamentos com seqüestrador de NO bloquearam parcialmente a indução do CAM em resposta ao ABA. Por fim, os tratamentos com quelante ou ionóforo de cálcio evidenciaram que o aumento na concentração citoplasmática desse íon desempenha uma função crucial na regulação da indução de A. comosus ao CAM em resposta ao estresse hídrico. De acordo com os resultados, alterações na concentração Ca2+ citossólico parecem representar um ponto de convergência entre as vias de sinalização dependente e independente de ABA que levam à indução do CAM em abacaxizeiro. Em conjunto, os dados obtidos no presente trabalho indicam que o ABA, o NO e o Ca2+ citossólico interagem durante os eventos que sinalização que resultam na transição de C3 para CAM em abacaxizeiro, enquanto que as citocininas parecem reprimir a expressão da fotossíntese CAM. / The Crassulacean acid metabolism (CAM) expression in C3-CAM facultative plants can be strongly modulated by a diversity of environmental and endogenous signals. Since pineapple (Ananas comosus, variety Smooth Cayenne) plants can perform either C3 or CAM photosynthesis when grown in vitro, this work attempted to investigate the involvement of four hormonal classes (abscisic acid, cytokinins, auxins and ethylene), cytosolic calcium (Ca2+cit.) and nitric oxide (NO) on the regulation of CAM expression in this bromeliad. To achieve this, the levels of these signaling compounds were measured during the pineapple C3-to-CAM induction and the CAM-to-C3 reversion. Furthermore, the degree of CAM expression in plants treated with these compounds and their inhibitors of synthesis, transport or perception was also analyzed. The data obtained showed that the endogenous levels of ABA were positively correlated with the degree of CAM expression in pineapple, since the C3-to-CAM transition and the CAM-to-C3 reversion in this bromeliad were preceded by, respectively, increases and decreases in the ABA leaf content. Consistent with these results; exogenously applied ABA increased the CAM expression in plants maintained in the absence of water stress, thus, indicating a stimulatory effect of this hormone on the A. comosus CAM expression. However, the inhibition of ABA accumulation did not affect the CAM induction by water stress, suggesting that the pineapple C3-to-CAM transition can occur via both ABA-dependent and ABA-independent signaling pathways. On the opposite, the data indicated that cytokinins act as negative regulators of CAM expression in pineapple, since the adding of this hormone partially inhibited the CAM induction by water stress and, additionally, the endogenous levels of the four cytokinins analyzed were inversely proportional to the degree of CAM expression in this bromeliad. Auxins and ethylene, conversely, seem not to be involved in the regulation of the C3-to-CAM transition and the CAM-to-C3 reversion in pineapple. On the other hand, the data obtained indicated, by the first time, a positive signaling role for the NO on the expression of CAM photosynthesis. For instance, it was observed that the exogenously applied NO increased the CAM expression in pineapple plants and, in agreement; there was an elevation in the production of this free radical during the water stress-induced C3-to-CAM transition. Additionally, the elevation of the NO synthesis in the pineapple leaf tissues occurred mainly in the chlorenchyma, which is the plant tissue responsible for most of the metabolic changes necessary to the CAM photosynthesis establishment. The results also suggested that the NO may act as a second messenger of the ABA signal in the pineapple CAM induction, since the production of this free radical in ABA-treated plants increased considerably and, in parallel, treatments with a NO scavenger partially blocked the ABA-induced C3-to-CAM transition. Finally, treatments with calcium chelator or ionophore indicated that the increase in the cytosolic concentration of this ion plays a crucial role in the regulation of the CAM induction by water stress in A. comosus.According to the results, changes in the concentration of Ca2+ cytosolic seem to represent a convergence point between the ABA-dependent and ABA-independent signaling cascade leading to CAM induction in pineapple. Taken together, the data obtained in the present work indicated that ABA, NO and cytosolic Ca2+ interact during the signaling events leading to the pineapple C3-CAM transition, while the cytokinins seem to repress the expression of CAM photosynthesis.

The bromeliads are conspicuous elements of the landscape and vegetation of Brazil, in the state of Sergipe occurs in the Atlantic forest ecosystems in the ecotone and caatinga. Bromeliads have an semiarid environment in adaptive capacity to occupy various habitats both on the ground, rocks and trees is partly attributed to its CAM photosynthetic response type obligatory and/or facultative. Isotopic studies to determine the leaf carbon isotope values show that these range from -10 to -28 of PDB standard. This study analyzed the isotopic composition of carbon and nitrogen organic matter and leaf in the crown of Aechmea aquilega at three habitats: Caatinga (white forest sclerophilous), Atlantic forest (Pirambu) and a transition area between Atlantic Forest and Caatinga, an exception area of white sand-quartizose. In each habitat were collected 4 bromeliads that live in isolated bush and four plants in the ground substrates with the objective of evaluating the hypothesis of facilitation of bromeliad-tank as accumulator of organic matter. The leaves and organic matter of the crown leaves were dried in a ventilated oven, crushed, sieved and made isotopic analysis of carbon-13, nitrogen-15, and total C:N on CENA-USP laboratories. The results of analysis of content C: N and isotope ratios showed significant variations of carbon and nitrogen in the crown of leaves, as well as the total abundance in both leaf biomass and particulate organic matter. Plants of Caatinga and Atlantic Forest obligatory assimilate carbon, while the ecotone of the bromeliads, the National Park of Serra de Itabaiana responded as much as in CAM binding to isolated bushes just as the composition of bromeliads is probably of autoctone origin-open grassy areas. The isotope ratio of the 15N is 22 times more enriched in the bromeliad leaf biomass of scrub plants in relation to the white sands and 2.6 higher than in the Atlantic forest habitat, while the particulate organic matter was enriched in all habitats, but the source this organic matter require explanation, however, the study supported the hypothesis on the functional role of facilitation in the three bromeliad habitats. According to the study, we observed that the adaptive success of higher plants associated with scrub bushes when the same was not observed in other habitats. In white sands bromeliads-tank, the substrate is sandy-quartzes hot, highly permeable, facilitating evaporation and drought in the summer suggesting that there is a condition of great stress, which these tank bromeliads are well adapted to soil and not on trees. / Estudos isotópicos para determinar os valores dos isótopos do carbono foliar mostram que estes variam -10 a -28 do padrão PDB. Este estudo analisou a composição isotópica do Carbono e Nitrogênio foliar e a matéria orgânica acumulada na coroa foliar de Aechmea aquilega de três habitats: Caatinga (Poço Verde), Mata Atlântica (Pirambu) e em um área de transição Mata Atlântica Caatinga (Areia Branca). Em cada habitat foi coletado quatro bromélias que vivem em moitas e quatro plantas isoladas em substratos do chão com o objetivo de avaliar a hipótese de facilitação da bromélia-tanque como acumuladora de matéria orgânica. As folhas e a matéria orgânica da coroa foliar foram secas em estufa ventilada, trituradas, peneiradas e as análises isotópicas do carbono, nitrogênio, teor de carbono e nitrogênio total foram realizadas no CENA-USP. Os resultados das analises de teor C:N e razões isotópicas mostraram variações significativas do carbono e nitrogênio na coroa foliar, assim como na abundância total tanto na biomassa foliar como na matéria orgânica particulada. As plantas da Caatinga e Mata Atlântica assimilam carbono facultativamente, enquanto as bromélias do ecótono, Parque Nacional da Serra de Itabaiana responderam como CAM obrigatórias tanto quando em moitas como isoladas, assim como estas bromélias tem composição de origem autóctone provavelmente de áreas abertas-graminosa. A razão isotópica do N15 é 22 vezes mais enriquecido na biomassa foliar das bromélias da Caatinga em relação às plantas das Areias Branca e 2,6 maiores que em habitat de Mata Atlântica, enquanto a matéria orgânica particulada em todos habitats foi enriquecida, porém a origem desta matéria orgânica necessita de explicações, todavia, o estudo apoiou a hipótese de facilitação no papel funcional da bromélia nos três habitats. De acordo com o estudo, foi observado que o sucesso adaptativo maior das plantas da Caatinga quando associada a moitas o mesmo não foi verificado nos outros habitats. Nas Areias Brancas, o substrato arenoso-quartizoso é quente, altamente permeável, favorecendo a evaporação e déficit hídrico no verão o que sugere que haja uma condição de grande estresse, a qual essas bromélias-tanque estão bem adaptadas no solo e não nas árvores.