Selenium (Se) is an essential mineral with functions for both animals and humans. There are several regions in the world deficient in this mineral and studies have related Se supplemented with reducing cholesterol. Thus, the objective of this study was to evaluate the Se effect in different levels and sources in the diet finishing of Nellore cattle on the performance and meat quality. It was used 63 Nellore cattle (412 kg and ± 24 months of age) in a completely randomized design with two sources (sodium selenite and selenium-enriched yeast) and four supplementation levels (0; 0.3; 0.9 and 2.7 mg Se/kg DM). There were no changes in performance and carcass characteristics. The Se level reduced (P<0.01) lipid and proteins oxidation (TBARS and carbonyl) compared to the control treatment on retail display storage (0, 2, 4 and 6 days). Organic Se, regardless of level, provided Se 138% higher (P<0.0001) in meat and 22.6% higher (P<0.0001) in serum than inorganic Se. The activity of glutathione peroxides (GPx) in muscle was 288% higher for animals supplemented with selenium and consequently, the cholesterol concentration in L. dorsi was 10.2% lower (P<0.001). The serum HMG-CoA reductase concentration was 32.7% lower in animals receiving Se supplementation (organic or inorganic). In conclusion, Se supplementation in beef cattle diet is a way of naturally producing selenium-enriched meat and with better quality for human consumption. / O selênio (Se) é um mineral essencial com funções para animais e humanos. Existem várias regiões do mundo deficientes neste mineral e estudos têm relacionado a suplementação de Se com a redução do colesterol. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes teores e fontes de Se na dieta de terminação de bovinos Nelore sobre o desempenho e a qualidade da carne. Foram utilizados 63 animais da raça Nelore (412 kg e ± 24 meses de idade) em delineamento inteiramente casualizado, com duas fontes (selenito de sódio e selênio levedura) e quatro teores de suplementação (0; 0,3; 0,9 e 2,7 mg Se/kg MS) em confinamento, durante 84 dias. Não houve alterações no desempenho e nas características de carcaça. O teor de Se reduziu (P <0,01) a oxidação lipídica e proteica (TBARS e carbonila) em comparação ao tratamento controle durante o armazenamento em simulação de exposição no varejo (0, 2, 4 e 6 dias). O Se orgânico, independentemente do teor, forneceu valor de Se 138% superior (P <0,0001) na carne e 22,6% superior (P <0,0001) no soro em relação ao Se inorgânico. A atividade glutationa peroxidase (GPx) no músculo foi 288% maior nos animais suplementados com selênio e, consequentemente, a concentração de colesterol na carne foi 10,2% menor (P <0,001). A concentração sérica de HMG-CoA redutase foi 32,7% menor nos animais que receberam suplementação de Se (orgânico ou inorgânico). Foi concluído que a suplementação com Se na dieta de bovinos de corte é uma forma de produzir carnes enriquecidas com selênio naturalmente e com melhor qualidade para consumo humano.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:35:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 284569.pdf: 1495105 bytes, checksum: b4504c0a28e414d6b42d9ecd0498ac9b (MD5) / As espécies reativas de oxigênio (ERO), metabólitos secundários do metabolismo do oxigênio, são moléculas geradas e reguladas constantemente pela célula. O aumento na sua produção pode levar a inúmeros processos patológicos, e para evitar esses efeitos tóxicos das ERO a célula conta com um complexo sistema de defesas celulares, incluindo defesas antioxidantes. Esse sistema é bem estudado e caracterizado em eucariotos mais complexos, como os mamíferos, e em eucariotos mais simples, como as leveduras, mas ainda pouco se sabe sobre esse sistema e sua regulação em invertebrados marinhos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo estudar o sistema antioxidante de bivalves marinhos em situação de estresse oxidativo, e propor possíveis mecanismos de modulação e regulação redox nesses modelos animais. O trabalho foi dividido em dois experimentos: no primeiro, mexilhões azuis Mytilus edulis foram pré-expostos ao selênio (4µg/L) por 3 dias, e subseqüentemente expostos por mais 3 dias a cobre (56 µg/L). Neste experimento, objetivamos detectar se os efeitos oxidativos do cobre podem ser atenuados pela pré-exposição ao selênio. Vários parâmetros antioxidantes e de dano celular foram avaliados. Nesta primeira etapa, observou-se que o cobre causa oxidação de tióis protéicos (PSH) e inibição da enzima tioredoxina redutase (TrxR) na brânquia e induz danos no DNA em hemócitos. O selênio aumenta a atividade da enzima glutationa peroxidase dependente de selênio (GPx-Se) e os níveis de glutationa (GSH). Quando os animais são pré-expostos a selênio e expostos em seguida ao cobre, a pré-exposição ao selênio é capaz de neutralizar os efeitos deletérios desse metal, revertendo a oxidação dos PSH, evitando a indução de danos no DNA e revertendo parcialmente a inibição da TrxR. No segundo experimento, mexilhões Perna perna foram expostos por até 21 dias ao zinco (10 µM), um metal conhecido por afetar o metabolismo da glutationa. A exposição aguda (2 dias) ao zinco causou consumo de GSH e inibição da GR, porém estes valores retornam aos níveis basais após 7 e 21 dias de exposição. Os animais expostos por 7 e 21 dias ao zinco demonstram uma amplificação do sistema antioxidante, com aumento na atividade de diversas enzimas auxiliares (TrxR, GR) ou de detoxificação de ERO (catalase, glutationa peroxidase total, superóxido dismutase). Apesar disso, essa amplificação não impediu um aumento nos níveis de peróxidos citosólicos e nos índices de peroxidação lipídica evidenciados após a exposição por 7 ou 21 dias. O conjunto de dados desses dois experimentos demonstram a importância do sistema antioxidante para esses animais em situações de estresse oxidativo. O aumento dos níveis de GSH e da atividade da GPx-Se parecem ser uma importante via de proteção contra os danos oxidativos em mexilhões M. edulis, mediados pelo cobre. Já com relação ao zinco, o restabelecimento do metabolismo da glutationa, o qual é afetado pelo zinco, é fundamental para as células branquiais de mexilhões P. perna, o qual responde ao insulto oxidativo com uma forte resposta adaptativa de amplificação das defesas antioxidantes celulares.

Submitted by DENISE APARECIDA CHICONATO (denise.ac@hotmail.com) on 2016-02-04T14:10:02Z No. of bitstreams: 1 Tese_Denise_Aparecida_Chiconato.pdf: 1322746 bytes, checksum: 5a673f4bca29c82501e188fb0ce8d28d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-05T12:07:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 chiconato_da_dr_jabo.pdf: 1322746 bytes, checksum: 5a673f4bca29c82501e188fb0ce8d28d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-05T12:07:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 chiconato_da_dr_jabo.pdf: 1322746 bytes, checksum: 5a673f4bca29c82501e188fb0ce8d28d (MD5) Previous issue date: 2016-01-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cana-de-açúcar é uma cultura mundialmente importante. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e se destaca na comercialização e exportação de açúcar e etanol originados a partir desta cultura. Os diferentes estresses abióticos alteram negativamente o desenvolvimento das plantas e, entre os estresses, a salinidade de solos se apresenta pela grave redução de produtividade, sendo o principal fator estressante em regiões de clima árido e semiárido. Este trabalho objetivou verificar os efeitos do NaCl sobre o desenvolvimento de plantas jovens de cana-de-açúcar, cultivares SP 81-3250 e IAC 87-3396, mediante o estudo de variáveis fisiológicas-bioquímicas: (I) os osmoprotetores prolina, glicina betaína e sacarose, (II) a ocorrência de alterações nutricionais pela relação Na+/K+, (III) a peroxidação lipídica (IV) a influência do NaCl na atividade da enzima redutase do nitrato; (V) o efeito do estresse salino nas trocas gasosas; (VI) o crescimento de parte aérea e raízes das diferentes cultivares de cana-de-açúcar sob estresse salino. Para tanto, foram utilizadas quatro concentrações de NaCl (0, 40, 80 e 160 mM) e realizadas as seguintes avaliações: teores de Na+ e K+ nas folhas e raízes, os osmólitos compatíveis prolina, glicina betaína e sacarose, potencial hídrico, a peroxidação lipídica, atividade da enzima redutase do nitrato, trocas gasosas, clorofilas totais, rendimento quântico do FSII e crescimento de parte aérea e raiz aos 15 e 30 dias de desenvolvimento após aplicação do estresse. A partir dos resultados, observou-se maior suscetibilidade das plantas da cv. IAC 87-3396 pelo maior acúmulo de Na+ e relação Na+/K+, maior peroxidação lipídica pelo acúmulo de MDA e maior efeito negativo sobre as trocas gasosas. Ambas as cultivares apresentaram acúmulo de prolina sob estresse, porém, plantas da cv. SP 81-3250 apresentaram, além de mais rápido acúmulo deste aminoácido, menor peroxidação lipídica e crescimento superior. Sob estresse salino severo a cv. IAC 87-3396 apresenta maior suscetibilidade. / Sugarcane is a globally important crop. Brazil is the largest producer of sugarcane and stands out in the marketing and exportation of sugar and ethanol derived from this culture. The various abiotic stresses adversely change plant growth and between the stresses, soil salinity is presented by the severe reduction in productivity, it is the main stressor in arid and semi-arid climates. This study aimed to verify the effects of NaCl on the development of sugarcane young plants, SP 81- 3250 and IAC 87-3396 cultivars, through the study of physiological-biochemical variables: (I) the osmoprotectors proline, glycine betaine and sucrose, (II) the occurrence of nutritional changes the ratio Na+/K+ (III) lipid peroxidation (IV) effect of NaCl in the activity of nitrate reductase enzyme; (V) the effect of salt stress on gas exchange; (VI) the growth of shoots and roots of the sugarcane cultivars under salt stress. Thus, it was used four concentrations of NaCl (0, 40, 80 and 160 mM) and made the following assessments: Na+ and K+ accumulation in the leaves and roots, compatible osmolytes: proline, glycine betaine and sucrose, water potential, peroxidation lipid, activity of nitrate reductase enzyme, gas exchange, total chlorophyll, quantum yield of PSII and shoot and root growth at 15 and 30 days of development after stress application. The results showed higher susceptibility of the cv. IAC 87-3396 by higher accumulation of Na+ and Na+/K+ ratio, increase in lipid peroxidation by MDA accumulation and greater negative effect on gas exchange. Both cultivars showed proline accumulation under stress, however, the cv. SP 81- 3250 showed in addition faster accumulation of this amino acid, reduced lipid peroxidation and higher growth. Under severe salt stress cv. IAC 87-3396 is more susceptible.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-11-24Bitstream added on 2014-06-13T20:47:23Z : No. of bitstreams: 1 santana_rk_dr_arafcf.pdf: 273636 bytes, checksum: 124503ffdad8ec844fb0d2464539002c (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A doença arterial coronariana representa uma das principais causas de morbidade e mortalidade das populações, principalmente naquelas que habitam regiões desenvolvidas. Os considerados fatores de risco para o desenvolvimento dessa doença são bastante conhecidos e analisados, sendo verificada uma importância cada vez maior com relação aos riscos genéticos e a verificação da associação de sistemas polimórficos humanos com a propensão a desenvolver uma determinada doença. A partir desses estudos foi possível imaginar a ocorrência dos denominados marcadores genéticos, onde os autores realizam uma tentativa com vistas às possibilidades de correlacionar esses marcadores com a doença analisada. Foi propósito do presente trabalho estabelecer e verificar a validade para o nosso laboratório de uma metodologia molecular capaz de caracterizar a mutação G1691A no gene do fator V da coagulação, a mutação G20210A no gene da protrombina e as mutações C677T e G1793A no gene da metilenotetrahidrofolato redutase. Com essa possibilidade, verificar e correlacionar as freqüências dessas mutações em portadores de doença arterial coronariana, de não portadores de doença arterial coronariana e em doadores de sangue em uma parcela da população paulista. Para tanto foram estabelecidos três grupos de estudo constituídos por moradores da região de São José do Rio Preto, Estado de São Paulo, sendo dois deles classificados por cinecoronariografia como portadores de doença arterial coronariana e como não portadores de doença arterial coronariana, enquanto um terceiro grupo foi constituído por doadores de sangue da mesma região. A idade dos pacientes variava dos 36 aos 84 anos de idade, enquanto a do terceiro grupo variava dos 18 aos 55 anos de idade... / The coronary artery disease is a major cause of morbidity and mortality of people, especially those who inhabit the developed regions. The considered risk factors for the development of this disease are quite known and analyzed, being observed an increasingly regard to the risks of genetic and a verification of human polymorphic systems’ association to the propensity to develop a particular disease. From these studies it was possible to imagine the occurrence of so-called genetic markers, where the authors hold an attempt to view the possibilities of these markers be correlated to the disease examined. The purpose of this work was to establish and verify the validity of a molecular methodology capable of characterizing the mutation in G1691A in the gene of the clotting factor V, the mutation in the gene G20210A prothrombin and of the mutations in the gene C677T and G1793A of methylene-tetrahydrofolate reductase. With this option, check and correlate the frequency of these mutations in individuals with coronary artery disease, in non individuals with coronary artery disease and in blood donors in a share of the Paulista population. Hence, three groups of study were established, consisting in residents of the region of Sao Jose do Rio Preto, São Paulo, two of them classified by coronary angiography as bearers of coronary artery disease and non bearers individuals with coronary artery disease, while a third group was set by donors of blood in the same region. The patients' ages ranged from 36 to 84 years old, while the third group ranged from 18 to 55 years old. The genomic DNA was extracted with Amersham Pharmacia Biotech’s Kit, and the characterization of alleles involved in the change G1691A (factor V Leiden), the prothrombin G20210A, and G1793A of MTHFR C677T determined by gene amplification, followed by the performance of restriction enzyme, in accordance with established protocol... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:31:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissEFLPS.pdf: 946605 bytes, checksum: 6b5081a456883dceba131a17735c7ac3 (MD5) Previous issue date: 2003-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / The cerradão is one of the forest physiognomy of the cerrado biome more threaded with the expansion of agricultural activities. The existence of remaining cerradão areas in the state with different sizes and conservation status show the necessity of studies in these areas. In São Paulo state, 237,918 ha of Cerrado Lato sensu are distributed in patches centered in two large regions, the first one, localized in the Central to North-Northeast region and the second, in the West region of the state. The study area was a cerradão patch has 1,735.55 ha, known as Oitocentos Alqueires , situated in Southwest of Estação Ecológica de Jataí in the Luís Antônio municipality, São Paulo state. We used 25 permanent plots of 250 m². The floristic survey characterized the vegetation like a cerradão and the vertical phytosociological parameters permitted us give to the species values through the Relative Sociological Position (RSP) and the Amplified Value of Importance index (AIVI), associating the horizontal phytosociological structure showed by the Value of Importance index (IVI) with the heterogeneity and irregularity of the cerradão strata. We founded that the studied area has a great number of shrub and arboreous individuals (5,284 individuals) beyond a high value of floristic diversity (3.47 nat.ind-1). The diameter and tall distributions showed abundance on the natural regeneration component due the great stock of young plants that compose the inferior stratum of the community. The natural regeneration analysis showed is essential to comprehend the establishment, survival and growth of the cerradão species. The regeneration component demonstrate that the density in the superior class was 700.80 ind.ha-1, in the median, 4,912.00 ind.ha-1 and in the inferior 1,296.11 ind.ha-1. Although the low density in of the inferior class, most of the populations in the cerradão community don t demonstrate regeneration problems and this aspect is clear due the great number of regenerating individuals in the median and superior classes. Using the phytosociological far evaluation of parameters and the rate of natural regeneration we selected 30 species and estimated the nitrate reductase activity (NRA) and the leaf nitrogen content. The analysis of leaf RNA and leaf nitrogen content suggests that the activity of the enzyme is not related with the content of NO3- in the ground and probably the plants of the study area use other nitrogen sources, beyond the NO3-, probably NH4+, that also was the predominant ion in relation to the NO3- in the ground. The 30 species had presented a diversification in the strategies of nitrogen assimilation having used as source, probably, NO3-, NH4+, micorriza and nodulation. How much to the foliar nitrogen tax it is important to stand out that of the ten species of bigger foliar nitrogen content, seven they are Leguminosae, indicating that this family possesss an efficient adaptation in the nitrogen assimilation. Low the correlation of the concentration of íons NO3- of the ground with the RNA confirm the hypothesis of that the species of the study area possess strategies to optimize the nitrogen assimilation, probably using NH4+ in the NO3- non-availability, besides making use of other assimilated mechanisms as nodulation and associations of micorrizas. Key words floristic and phytosociology, cerradão, arboreous and shrub vegetation, natural regeneration, nitrate reductase activity, leaf nitrogen content, NO3-, NH4+. / O cerradão é uma das fisionomias florestais do bioma cerrado mais ameaçada pela expansão das atividades agrícolas. A existência de áreas remanescentes de cerradão no estado de São Paulo com diversos tamanhos e padrões de conservação mostrou a necessidade de estudos nessas áreas. No estado de São Paulo 237.918 ha de cerrado Lato sensu estão distribuídos na forma de fragmentos, que estão concentrados em duas grandes regiões, a primeira, localizada do Centro para o Norte-Nordeste e a segunda, na região Oeste do estado. A área de estudo foi um fragmento de cerradão com 1.735,55 ha, denominado Oitocentos Alqueires, localizado a Sudoeste da Estação Ecológica de Jataí no município de Luís Antônio, estado de São Paulo. Foram empregadas 25 parcelas permanentes de 250 m2. O levantamento florístico caracterizou a vegetação como um cerradão e os fundamentos dos parâmetros fitossociológicos verticais permitiram valorar as espécies através da Posição Sociológica Relativa (PSoR) e do Índice de Valor de Importância Ampliado (IVIA), os quais juntamente com a estrutura fitossociológica horizontal, denotada pelo Índice de Valor de Importância (IVI), evidenciaram a heterogeneidade e a irregularidade dos estratos do cerradão. Os resultados mostraram que a área de estudo possui um grande contingente de indivíduos arbustivos e arbóreos (5.284 indivíduos), além de um alto valor de diversidade florística (3,47 nat.ind.-1). As distribuições diamétrica e de altura revelaram abundância no componente da regeneração natural devido um grande estoque de plantas jovens que compõem o estrato inferior da comunidade. A análise da regeneração natural mostrou-se essencial na compreensão do estabelecimento, da sobrevivência e do crescimento das espécies de cerradão. O componente da regeneração mostrou que a densidade na classe superior foi de 700,80 ind.ha-1, na classe média, 4.912,0 ind.ha-1 e na inferior, 1.296, 11 ind.ha-1. Apesar da baixa densidade da classe inferior, a maioria das populações da comunidade de cerradão não demonstra problemas de regeneração e esse aspecto fica evidenciado pelo grande número de indivíduos regenerantes nos estratos superior e médio. Com base nos parâmetros fitossociológicos horizontais e verticais e na taxa de regeneração natural, 30 espécies foram selecionadas e de cada uma delas foi estimado a atividade da nitrato redutase (ANR) e a concentração de nitrogênio foliares. A análise da ANR e de conteúdo de nitrogênio foliares sugere que a atividade da enzima não está relacionada com o conteúdo de NO3- no solo e provavelmente as plantas da área de estudo utilizam outras fontes de nitrogênio, além do NO3-, provavelmente NH4+, que inclusive foi o íon predominante em relação ao NO3- no solo. As 30 espécies apresentaram uma diversificação nas estratégias de assimilação de nitrogênio utilizando como fonte, provavelmente, NO3-, NH4+, micorriza e nodulação. Quanto à taxa de nitrogênio foliar é importante ressaltar que das dez espécies de maior conteúdo de nitrogênio foliar, sete são Leguminosae, indicando que esta família possui uma eficiente adaptação na assimilação de nitrogênio. A baixa correlação da concentração de íons NO3- do solo com a ANR confirma a hipótese de que as espécies da área de estudo possuem estratégias para otimizar a assimilação de nitrogênio, provavelmente utilizando NH4+ na indisponibilidade de NO3-, além de disporem de outros mecanismos assimilatórios como nodulação e associações de micorrizas. Palavras-chave florística e fitossociologia, cerradão, vegetação arbustivo-arbórea, regeneração natural, atividade da nitrato redutase, conteúdo de nitrogênio foliar, NO3-, NH4+.

A cristalografia de raios-X e um método de singular importância para a determinação da estrutura de macromoléculas. A importância em resolver estruturas de proteínas continua a crescer em campos variando desde a bioquímica e biofísica básicas ate o desenvolvimento farmacêutico e biotecnologia. o presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalográficos de três diferentes moléculas biológicas. Calgranulina C de granulócitos porcinos, uma proteína que liga cálcio, supostamente envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parâmetros de rede a=b=54.35 e c=141.32&#197, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Várias tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituição molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos \"EF-hands\" quando da ligação ao íon cálcio podem ser responsáveis pelo insucesso dos resultados. Tripanotiona redutase de T. cruzi e um excelente alvo para modelagem de inibidores e potenciais drogas contra a doença de Chagas. O complexo mutante TR + GSPD foi cristalizado com parâmetros de rede a=b=92.7 e c=156.2&#197, grupo espacial P43. Um conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rígido contra as coordenadas da TR nativa. O modelo foi refinado a 2.4&#197 de resolução, Rfactor=19.8%. Fosfolipase A2 extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni foi cristalizada com parâmetros de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2&#197 e &#946=125.1&#176, grupo espacial C2. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o dímero da fosfolipase A2 de Crotalus atrox como modelo. A analise de sua seqüência de aminoácidos e necessária para posteriores ciclos de refinamento. / X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of macromolecules. The importance of solving protein structures continues to grow in fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development and biotechnology. The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological molecules. Calgranulin C from pig granulocytes, a calcium binding protein though to be involved in regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and c=141.32&#197, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results. Trypanothione reductase (TR) from T. cruzi is a target enzyme for modeling an inhibitor for Chagas´ disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with a=b=92.7 and c=156.2&#197, space group P43. A preliminary set of phases was obtained by rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined to 2.4&#197 resolution, Rfactor=19.8%. Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake Bothrops moojen; was crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2&#197 and &#946=125.1&#176, space group C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of phospholipase A2 from Crotalus atrox as a model. The aminoacid sequence analysis is needed for further refinement cycles.

A situação da tuberculose (TB) foi alterada de forma significativa pela síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA ou AIDS) e pelo aparecimento de novas cepas do Mycobacterium tuberculosis resistentes ao tratamento quimioterápico, que justificariam a pesquisa de novos agentes antimicobacterianos. Alvos interessantes têm emergido para o planejamento racional de novos fármacos contra a TB, particularmente, considerando processos metabólicos específicos que ocorrem durante a biossíntese da parede celular micobacteriana e que envolvem a síntese de ácidos graxos (FAS-II, fatty acid synthase). O sistema FAS-II constitui diferença bioquímica importante entre mamíferos e micobatérias. A enzima enoil-acp (acyl carrier protein, proteína acil-carregadora) redutase (ENR) é alvo determinante no sistema FAS-II, responsável pela etapa de alongamento dos ácidos micólicos, que são os principais componentes da parede celular do M. tuberculosis. O presente projeto tem como objetivo a aplicação de metodologias do planejamento de fármacos auxiliado por computador, CADD (Computer-Aided Drug Design), em um conjunto de derivados pirrolidina carboxamidas descritos como inibidores potenciais da ENR do M. tuberculosis (InhA) com intuito de mapear o farmacóforo, investigar a orientação dos ligantes no sítio ativo e os tipos de interações que se estabelecem com os resíduos de aminoácidos do sítio de interação. Inicialmente, investigaram-se as relações quantitativas entre estrutura química e atividade biológica (QSAR, quantitative structure-activity relationships) com aplicação de abordagem multivariada. O melhor modelo QSAR indicou que propriedades estruturais, termodinâmicas e eletrônicas devem ser consideradas no processo de planejamento e proposição de novos protótipos potencialmente tuberculostáticos. / The incidence of tuberculosis (TB) disease has significantly changed considering the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) co-infection as well as the emergence of new Mycobacterium tuberculosis strains resistant to the currently chemotherapy. These facts support the search for novel antimycobacterial agents. Interesting targets have been elucidated and could be used for the rational design of new drugs against TB, primarily those related to specific biochemical metabolic pathways that occur during the cell wall biosynthesis, specially involved in the fatty acid synthase (FAS) system. The FAS-II system is an important biochemical difference between mammals and mycobacteria. The enoyl-ACP reductase (ENR) is the key enzyme in the FAS-II system, responsible for the elongation step of mycolic acids, which are the major components in the M. tuberculosis cell wall. This research project aims the application of computer-aided drug design (CADD) methodologies to a set of pyrrolidine carboxamide derivatives, which were previously reported as potential M. tuberculosis ENR (InhA) inhibitors, for mapping the pharmacophore, investigating the ligands\' orientation at the active site and also the interaction types regarding the amino acid residues in the active site. Initially, the quantitative structure-activity relationships (QSAR) were performed applying a multivariate approach. The best QSAR model indicated the structural, thermodynamic, and electronic properties must be taken into account in the design of novel leads as potential antituberculosis agents.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Inhibition of the folate metabolism is an important strategy in the treatment of infectious diseases. In the folate metabolism, the dihydrofolate reductase (DHFR) catalyses the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate. This metabolite is essential for the synthesis of DNA and proteins. Therefore, developing new dihydrofolate reductase antagonist has been considered as a good strategy to improve infectious diseases treatment. In this work, a quantitative study of structure-activity relationship of 17 diaminonazolines inhibitors of the Staphylococcus aureus DHFR (SaDHFR), were performed by using multiple linear regression. Seven inhibitors, not included in the training group, were used to validate the QSAR model. In addition, molecular docking was used to study molecular recognition between SaDHFR and diaminoquinazolines derivatives. Moreover, theoretical pharmacokinetics and toxicological profile was determined for the most potent ligands. The molecular docking study suggest that hydrophobic interactions between the ligand and the residues Ile51, Phe93, Leu55, Val32 and Leu29, are important for potency. The model of QSAR generated values of R2 training, Q2 and R2 pred equal to 0.90, 0.90 and 0.65, respectively. The descriptors included in the model, indicate the importance of pKa and molar refractivity biological activity. The analogs 28A-12, 28A-13 e 28A- 21 exhibit a favorable theoretical pharmacodynamics, pharmacokinetics and toxicological profile. The results obtained for different computational approaches, may be useful in design of new antimicrobial drugs more potent and with few side effects. / A inibição do metabolismo do folato é uma importante estratégia no tratamento de doenças infecciosas. No metabolismo do folato, a enzima diidrofolato redutase (DHFR) catalisa a redução do diidrofolato a tetraidrofolato. Este metabólito é essencial para a biossíntese de DNA e proteínas. Portanto, o desenvolvimento de novos antagonistas da diidrofolato redutase tem sido considerado como uma boa estratégia para melhorar o tratamento das doenças infecciosas. No presente trabalho, foi desenvolvido uma relação estruturaatividade a partir de 17 diaminoquinazolinas inibidoras da DHFR do Staphylococcus aureus (SaDHFR) empregando para isso, a regressão linear múltipla. Sete inibidores, não incluídos no grupo treino foram usados para validar o modelo de QSAR. Em adição, docagem molecular foi empregada para avaliar o reconhecimento molecular entre a SaDHFR e a série de diaminoquinazolinas. Além disso, os perfis farmacocinéticos e toxicológicos teóricos foram avaliados para os ligantes mais potentes. Os resultados obtidos por docagem molecular sugerem que as interações hidrofóbicas entre os ligantes e os resíduos Ile51, Phe93, Leu55, Val32 e Leu29, são importantes para a potência dos ligantes. O modelo de QSAR desenvolvido apresentou valores de R2treino, Q2 e R2pred igual a 0.90, 0.90 e 0.65, respectivamente. Os descritores incluídos no modelo, indicam a importância do pKa e da refratividade para a atividade biológica. Os análogos 28A-12, 28A-13 e 28A-21 exibem um perfil farmacodinâmico, farmacocinético e toxicológico favorável. Os resultados obtidos por meio de diferentes abordagens computacionais podem ser úteis no planejamento de novos fármacos antimicrobianos mais potentes e com menos efeitos colaterais.

Orientador: Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarceloLeitedos_D.pdf: 11878298 bytes, checksum: ee2390825183c2b5891dddf20f4e2509 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nesta tese são apresentados os resultados da caracterização estrutural, principalmente por Cristalografia e Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos (SAXS), de importantes proteínas de venenos de serpentes e de semente de milho. Modelos estruturais foram obtidos para diferentes fosfolipases A2 (PLA2) de venenos, destacando-se dois modelos cristalográficos para uma PLA2 de Bothrops jararacussu resolvidos nos grupos de espaço P3121 e P212121, numa resolução máxima de 1,83 Å e 1,98 Å, cujos valores finais de Rfactor iguais a 19,7 % e 17,3 % (Rfree = 26,5 % e 23,8 %) foram obtidos, respectivamente. Ambos modelos apresentaram um inesperado fator de agregação plaquetária em seu sítio ativo e um interessante padrão pentagonal de moléculas de água altamente organizadas na superfície externa do canal hidrofóbico. Também foram recuperados envelopes de SAXS para uma PLA2 de Crotalus durissus cascavella, antes e após seu tratamento com naringina, que apresentaram uma nova configuração dimérica para fosfolipases A2 em solução e permitiram identificar o provável sítio de interação deste flavonóide. As proteínas de semente estudadas são aldose redutases (AR), as quais parecem estar envolvidas no metabolismo de sorbitol no milho. Esta mesma enzima em humanos está diretamente relacionada com complicações diabéticas em situações de hiperglicemia ao catalisar a conversão da glicose em excesso a sorbitol, que por sua vez é extremamente tóxico às células. Ao todo, seis modelos cristalográficos (apoenzima, complexos com cofatores enzimáticos e complexos ternários) foram obtidos para ARs específicas do embrião e endosperma. Dois destes modelos tiveram seu refinamento estrutural finalizado. O primeiro, para a apoenzima AKR4C7 do endosperma, apresentou valores finais de Rfactor e Rfree iguais a 16,6 % e 20,0 % a uma resolução máxima de 1,45 Å. O segundo, para o complexo da AKR4C13 do embrião com o cofator enzimático NADPH, convergiu para valores de Rfactor e Rfree iguais a 15,4 % e 18,9 % também a uma resolução máxima de 1,45 Å. Análises preliminares dos modelos cristalográficos das ARs de milho foram realizadas com intuito de investigar as possíveis razões para a existência de atividade catalítica frente ao sorbitol, mas não para glicose. De modo geral, as principais características estruturais destas e de ARs de outros organismos são conservadas, incluindo os resíduos do sítio ativo e suas conformações. Assim, mais estudos ainda são necessários até que se possa compreender as razões para a predileção ao sorbitol, em detrimento da glicose, pelas ARs da semente de milho / Abstract: This PhD thesis presents the results of a structural characterization of important proteins from snake venoms and maize seed mainly through Crystallography and Small-Angle X Ray Scattering (SAXS). Structural models were obtained for different phospholipases A2 (PLA2) from snake venoms, remarkably two crystallographic models for a PLA2 from Bothrops jararacussu in whose active site it was found an unexpected platelet aggregation factor and an interesting pattern of water clusters showing a highly organized pentagonal distribution that was found on the outside of the models¿ hydrophobic channel. Refined crystal structures were obtained at 1.98 Å and 1.83 Å resolution for crystals belonging to the space groups P212121 and P3121, showing crystallographic (Rfactor) and Rfree values of 17.3 % and 23.8 % for the space group P212121 and 19.7 % and 26.5 % for the space group P3121. SAXS envelopes for a PLA2 from Crotalus durissus cascavella treated and non-treated with naringin which allowed to identify possible flavonoid binding sites were also recovered. In addition, it was observed that C. d. cascavella dimers present a new extended configuration never seen before for phospholipases A2 in solution. The seed proteins studied are aldose reductases (AR) that seems to be related with sorbitol metabolism in maize. In humans, aldose reductases are straightly related with diabetic complications in hyperglycemic situations where the conversion of excess glucose to sorbitol induces serious cellular damage, since this product is extremely toxic to cells. Altogether, six crystallographic models for apoenzyme, complexes with enzymatic cofactors and ternary complexes were obtained for specific ARs from embryo and endosperm. The structural refinement for two of these models was already finished. The first model was obtained for the apoenzyme AKR4C7 from maize endosperm that presented Rfactor and Rfree values of 16,6 % and 20,0 %, respectively, at a maximum resolution of 1,45 Å. The second corresponds to the AKR4C13 from maize embryo complexed with the enzymatic cofactor NADPH for which crystallographic Rfactor of 15,4 % and Rfree of 18,9 %, at a maximum resolution of 1,45 Å, were obtained. Maize AR models were analyzed aiming at evaluate possible reasons for the lack of catalytic activity for glucose. In general, the main structural features of these ARs and from other organisms are conserved, including the active site residues and their conformations. Thereby, additional studies are still necessary to understand the reasons for the sorbitol preference over glucose in the enzimatic activity of maize aldose reductases / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosselli_LucianaKauer_D.pdf: 3396544 bytes, checksum: 1ed6069e60d6f5966add93778319a1d0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o programa de seqüenciamento genômico da bactéria Xylella fastidiosa gerou um enorme número de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes às categorias de patogenicidade, virulência e adaptação deste importante fitopatógeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeído desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a análise de sua seqüência primária de aminoácidos revelou similaridades com proteínas pertencentes à superfamília de aldo-ceto redutases. As proteínas desta superfamília são oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a seqüência similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressão pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteína recombinante fusionada a seis resíduos de histidina em Escherichia colí BL21(DE3). A proteína expressa na fração solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteúdo de sua estrutura secundária foi verificado por espectroscopia de dicroísmo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 Á e máxima dimensão de 90 Á) e indicaram que a proteína apresenta-se como um monômero em solução. Além disto, os cálculos estruturais ab initio mostraram que a proteína apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteína XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a redução dos substratos DL-gliceraldeído (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presença de NADPH. A seqüência de aminoácidos da proteína XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inúmeras proteínas de função desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% dê identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteína XF 1729 como um novo membro da superfamília das AKRs, da nova sub-família AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterização por cromatografia de gel filtração indicaram que a proteína apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Além da proteína AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteínas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e função. A proteína HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteínas da família phosphopantetheinyl transferase, sendo necessária à síntese de ácido graxo via acetato na bactéria. A proteína XF1532, de 36,8 kDa, é sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua seqüência similar (44%) à proteína OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence à família LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto não foi possível obter a proteína na fração solúvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterização estrutural e funcional. A descrição da metodologia utilizada para produção destas proteínas e os resultados preliminares obtidos estão descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo benefício no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o seqüenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a função das proteínas codificadas por seus genes / Abstract: The Xylella fastidiosa genome program generated a large number of gene sequences that belong to pathogenicity, virulence and adaptation categories from this important plant pathogen. One of these genes (XF 1729) was described in the genome annotation as being a phenylacetaldehyde dehydrogenase. However, the XF 1729 primary sequence analysis showed similarities to Aldo-keto reductase superfamily proteins. The AKRs are NADPH-dependent oxidoreductases structurally and functionally related. In this work, the similar sequence XF 1729 from Xylella fastidiosa was cloned onto the pET32Xa/LIC vector in order to over-express a recombinant His- Tag fusion protein in E. coli BL21(DE3). The expressed protein in the soluble fraction was purified 'by immobilized metal affinity chromatography (agarose-IDA-Ni resin). Secondary structure contents were verified by circular dichroism spectroscopy. Small-Angle X Ray Scattering (SAXS) measurements furnish general structural parameters (the particle radius of gyration of 27.5:J::0.8A and the particle maximum dimension of 90A) and provide a strong indication that the protein has a monomeric form in solution. Also, ab initio calculations show that the protein has some similarities with a previously crystallized aldo-keto reductase protein. The recombinant XF1729 purified to homogeneity catalyzed the reduction ofDL-glyceraldehyde (Kcat 2.26 S-I, Km 8.20:J:: 0.98 mM) and 2-nitrobenzaldehyde (Kcat 11.74 S-I, Km 0.14:J:: 0.04 mM) in the presence of NADPH The amino acid sequence deduced from XF 1729 showed the highest identity (40% or higher) with several functionally unknown proteins. Among the identified AKRs, we found approximately 29% of identity with YakC (AKR13) from Schizosaccharomyces pombe, 30% and 28% with AKR11A and AKR11B, both from Bacillus subtilis, respectively. The results establish XF 1729 as the new member of AKR family, AKR13B1. Finally, the first characterization by gel filtration chromatography assays indicates that the protein has an elongated shape, which generates an apparent higher rnolecular weight. Since Xylellafastidiosa 9a5c strain (associated with CVC) is the first plant pathogen to be fully sequenced, a large benefit for the whole field of disease research can be expected. An initial step has been taken towards the characterization the protein function encoded by its genes / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular