Peptídeos com ação inibitória da enzima conversora da angiotensina I (ECA) podem ser obtidos a partir de diversos alimentos e exercer efeito anti-hipertensivo. O cupuaçu (Theobroma grandiflorum S.), fruto nativo da Amazônia, possui sementes comestíveis contendo proteína de reserva similar à do cacau (Theobroma cacao L.), as quais parecem ser fonte de peptídeos inibidores da ECA. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi investigar in vitro a ocorrência de peptídeos inibidores da ECA no hidrolisado proteico da semente de cupuaçu obtido por ação da Alcalase. O hidrolisado revelou o desaparecimento de proteínas entre 27 a 180 kDa, incluindo as globulinas, e o surgimento daquelas abaixo de 15 kDa após 2 h de hidrólise, indicando a formação de peptídeos menores. O ensaio de atividade utilizando o substrato Abz-FRK(Dnp)-P-OH revelou que o hidrolisado total promoveu 65% de inibição da ECA e esse pool peptídico foi fracionado em cinco frações (F1-F5) por cromatografia em fase reversa (RP-HPLC). Após a etapa de purificação, o monitoramento da inibição apontou, ao final, duas frações (3.2.8 e 3.4.10) com maior atividade inibitória. Oito peptídeos foram identificados por LC-MS/MS, sendo três deles já conhecidos como inibidores da ECA. Outros cinco novos peptídeos identificados (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF e MEKHS) foram sintetizados e tiveram sua ação inibitória validada por ensaios in vitro. O peptídeo GSGKHVSP apresentou a menor IC50 (3,11 µM) e Ki (0,74 µM), sendo um inibidor tipo misto quanto ao seu mecanismo de inibição revelado pelo gráfico de Lineweaver-Burk. Os resultados permitem concluir que o isolado proteico da semente de cupuaçu pode ser uma fonte para obtenção de peptídeos anti-hipertensivos, a despeito de serem necessárias investigações sobre a resistência desses peptídeos à digestão gastrointestinal e a eficácia da inibição in vivo. / Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity may be obtained from several foods and cause antihypertensive effect. Cupuassu (Theobroma grandiflorum S.), a native fruit from Amazon, has edible seeds with a storage protein similar to that of cocoa (Theobroma cacao L.) which seems to have incrypted ACE inhibitor peptides. Thus, the aim of this project was to investigate the in vitro formation of ACE inhibitory peptides in protein hydrolysate from cupuassu seeds using Alcalase enzyme. The hydrolysate revealed the disappearance of proteins between 27 and 181 kDa after 2h hydrolysis, including the globulin, and the increase of those below 15 kDa, indicating the formation of peptides. The ACE inhibitory activity assays using the substrate Abz-FRK(Dnp)P-OH revealed the hydrolysate had 65% ACE inhibition and the pool of peptides was fractionated into five fractions (F1-F5) by reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). After the purification step, two fractions (3.2.8 e 3.4.10) exhibited the highest ACE-inhibitory activity. Eight peptides had been identified by LC-MS/MS and three of them were ACE inhibitors. The other newly identified peptides (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF and MEKHS) were synthesized and in vitro assayed for ACE inhibitory activity. The peptide GSGKHVSP had the lower IC50 (3.11 µM) and Ki (0.74 µM). Lineweaver-Burk plots suggest this peptide is a mixed-type inhibitor according to the inhibition mechanism. The results indicate that protein isolate from cupuassu seeds may be a good protein source of antihypertensive peptides and further investigation is needed in order to evaluate the resistance of these peptides to gastrointestinal digestion and the inhibitory activity in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-29042015-100916 |
| Date | 05 February 2015 |
| Creators | Juliana Nunes da Cruz |
| Contributors | João Roberto Oliveira do Nascimento, Neuza Mariko Aymoto Hassimotto, Ursula Maria Lanfer Marquez, Daniel Carvalho Pimenta |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciência dos Alimentos, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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