Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? / Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/313943 |
| Date | 18 August 2018 |
| Creators | Ferreira, Sandra Mara, 1982- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Carneiro, Everardo Magalhães, 1955-, Boschiero, Antonio Carlos, 1943-, Silva, Silvana Auxiliadora Bordin da, Werneck, Claudio Chrysostomo |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 49 f. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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