Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:22:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_AdrianadaSilvaSantos_D.pdf: 10849571 bytes, checksum: 5933b39c78d15eee6a1a067f3e9cd55b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A identificação e caracterização estrutural e funcional de genes diferencialmente expressos entre tecidos tumorais e normais constituem etapas fundamentais para permitir a compreensão do processo neoplásico e o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e verificar sua função nos processos celulares. Neste estudo foi demonstrado que o gene ANKHD1localiza-se no cromossomo 5, possui vários transcritos variantes possivelmente gerados por mecanismos de clivagem alternativa e codifica proteínas com domínios de repetições de anquirina. A região promotora desse gene possui vários elementos regulatórios importantes como sítios de ligação ao fator de transcrição GATA-1 e sequências ricas em dinucleotídeos CG, as ilhas CpG. A expressão do gene ANKHD1 e de algumas de suas variantes em tecidos normais e em linhagens de células neoplásicas foi detectada em intensidades variáveis. Em modelos de diferenciação e proliferação celular foi demonstrado o aumento da expressão desse gene ao longo desses processos. No entanto durante o processo de apoptose observou-se diminuição na expressão de ANKHD1 e transcritos variantes. Em células de pacientes diagnosticados com Síndrome Mielodisplásica (SMD) foi constatada baixa expressão de ANKHD1. Durante a diferenciação eritróide de células CD34+ obtidas de medula óssea desses pacientes não foi observado o aumento da expressão do gene ANKHD1 e do fator de transcrição GATA-1 como era esperado. As células mononucleares de pacientes com SMD tratadas com decitabina, um agente desmetilante, apresentaram aumento na expressão do gene ANKHD1 em comparação às células não tratadas. O mesmo foi observado em células CD34+ tratadas durante a diferenciação eritróide. No entanto em células de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e com Mieloma Múltiplo (MM), caracterizadas pela proliferação e resistência aos mecanismos de apoptose, foi demonstrada a alta expressão do gene ANKHD1 e de seus transcritos variantes. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada através de Western Blotting, em células da linhagem de MM denominada RPMI 8226. Foi observada a diminuição da expressão do gene ANKHD1 nessas células quando induzidas ao processo de apoptose por dexametasona. Em conclusão o presente estudo identificou ANKHD1 e alguns de seus transcritos variantes como um novo gene com perfis de expressão variados em células hematopoéticas normais e neoplásicas, demonstrou seu envolvimento em processos celulares básicos à manutenção da homeostase e a sua associação com SHP2 em Mieloma Múltiplo. ANKHD1 pode estar envolvida com o fenótipo anormal da célula neoplásica através de uma possível função na via da apoptose. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e neoplásicas. / Abstract: The identification and the structural and functional characterization of genes differentially expressed between tumors and normal tissues are fundamental steps towards the understanding of the neoplastic process and the development of new anti-cancer strategies. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, the expression pattern and function of ANKHD1 have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene expression pattern of ANKHD1 in normal and leukemic hematopoietic cells and to determine their function in cellular process.This study has demonstrated that the ANKHD1 gene is located on chromosome 5, this gene has several possible variant transcripts generated by splicing alternative mechanisms and encodes proteins with domains of ankyrin repeats. The promoter region of this gene has several regulatory elements such as the transcription factor GATA-1 binding sites and rich sequences in dinucleotide CG, CpG islands.The expression of the ANKHD1 gene and some of the gene's variants in normal tissues and neoplastic cell lines was detected in different intensities. The increase in the expression of this gene was demonstrated using cellular differentiation and proliferation models. However, during the process of apoptosis, a decrease in the expression of ANKHD1 transcripts variants was observed. In the cells of patients with myelodysplastic syndrome (MDS), a low expression of ANKHD1 was observed. During erythroid differentiation of CD34+ cells obtained from the bone marrow of these patients, no increase in the expression of ANKHD1 gene and transcription factor GATA-1 was observed, as expected. The mononuclear cells of MDS patients were treated with decitabine, a demethylation agent, and showed an increase in the ANKHD1 gene expression compared to untreated cells. The same was observed in CD34+ cells treated during erythroid differentiation. However in cells of acute myeloid leukemia (AML) or Multiple Myeloma (MM) patients, characterized by proliferation and resistance mechanisms of apoptosis, the high expression of gene transcripts ANKHD1 and its variants was demonstrated. The association of SHP2 with ANKHD1 was identified by Western Blot in RPMI 8226 MM cell line. A decrease in the ANKHD1 gene expression in these cells when the process of apoptosis was induced by dexamethasone was observed. In conclusion, this study identified ANKHD1 and some of gene's transcripts variants as a new gene with a variable expression profile in normal and neoplastic hematopoietic cells. The study has also demonstrated the involvement of the ANKHD1 in basic cellular processes, which maintain homeostasis and the association of ANKHD1 with SHP2 in multiple myeloma. ANKHD1 may be involved with the abnormal phenotype of tumor cells through a possible role in the apoptosis pathway. The findings herein described suggest that ANKHD1 could be a molecular target for neoplasic disease therapy and could guide further studies towards a better elucidation of the specific functions of ANKHD1 in normal and neoplasic hematopoietic cells. / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_M.pdf: 1558318 bytes, checksum: d69677a862aa6ba8e96725b7d5c76a87 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? / Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular