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ARHGAP21 inibe a secreção de insulina estimulada por glicose através da modulação aa FAK, CDC42 E PKC'dzeta' / ARHGAP21 inhibits glucose-stimulated insulin secretion through through FAK, CDC42 and PKC'dzeta '

Ferreira, Sandra Mara, 1982- 18 August 2018 (has links)
Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_M.pdf: 1558318 bytes, checksum: d69677a862aa6ba8e96725b7d5c76a87 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? / Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
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Avaliação de parametros funcionais e morfologicos da ação da angiotensina II sobre segmentos de tubulos proximais isolados e conservados em soluções de euro-collins e belzer / Funcional and morphological behavior of preserved PCT during treatment using angiotensin II and Losartan

Bertels, Ivone Medeiros Vieira 13 August 2018 (has links)
Orientador: Jose Francisco Figueiredo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertels_IvoneMedeirosVieira_D.pdf: 6733194 bytes, checksum: c8a7c3bcca8ad5732334627b49957dcc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: A qualidade da conservação obtida em um órgão e a duração do armazenamento seguro são dependentes do tipo de solução e tempo de conservação, estando sujeitas a intercorrências imprevisíveis. Em virtude disso, o parênquima renal e, particularmente, o túbulo contornado proximal (TCP), local onde ocorre necrose tubular aguda (NTA), são susceptíveis às mudanças na homeostase funcional do órgão, durante a conservação e durante a reperfusão pós-implante. O TCP reabsorve cerca de 70% de Na+ e H2O filtrados; sua membrana apical tem células especializadas com microvilosidades para aumentar a área de transporte unidirecional de solutos do lúmen para o sangue. O principal componente estrutural da bordadura em escova, filamentos de F-actina, interage com uma variedade de proteínas transmembranas, inclusive moléculas transportadoras de íons. Esta função é regulada por parâmetros fisiológicos e hormonais, sendo a Angiotensina II (AII) uma das principais envolvidas com o citoesqueleto de actina e proteínas associadas, mediada principalmente por seus receptores AT1. Métodos: Neste trabalho, túbulos isolados de fragmentos frescos e de fragmentos conservados por períodos de 1 e 24h nas soluções de Euro - Collins (ECO) e de Belzer (UW) foram tratados com AII, losartan e AII+losartan, para medida do volume de absorção de fluido (Jv=nl. min_1. mm-1 (microperfusão in vitro), e medida da intensidade (média) de pixel da fluorescência dos receptores AT1 e do citoesqueleto de actina (imunoistoquímica). Resultados: a) Demonstrou-se que AII (10-12M) estimula absorção fluida (Jv), que é diminuída com losartan (10-6M) em TCP frescos e também em TCP conservados em soluções de ECO 1h e UW 1-24h. Em túbulos conservados 24h em ECO, não houve absorção de fluidos. b) A média da intensidade de pixel de fluorescência dos receptores AT1 em túbulos frescos (sem conservação) apresentou discreta variação entre os grupos não estatisticamente significante. Em túbulos conservados 1h com ECO e UW, a média da intensidade de pixel de receptores AT1 estava aumentada no grupo sem drogas, quando comparados aos tratados com AII, losartan e AII+losartan. Entretanto, em túbulos conservados 24h, ambas as soluções, houve aumento na média de intensidade do pixel de receptores AT1, no grupo tratado com AII, quando comparados aos demais grupos. c) O citoesqueleto de actina em túbulos frescos (sem conservação) não mostrou variação estatisticamente significante na média de intensidade de pixel entre os grupos (AII, losartan ou AII+losartan). No entanto, verificamos uma maior coesão entre os filamentos de actina de túbulos tratados com AII. A distribuição dos filamentos de actina em túbulos conservados em ECO 1h e UW 1 e 24h, mostrou-se uniforme, sem diferenças entre os grupos. Entretanto, em túbulos conservados em ECO 24h (tratamentos AII, losartan, AII+losartan) foi verificada alteração do citoesqueleto de actina. Conclusão: Baseados nestes dados, verificamos que, na conservação do TCP realizada por tempo reduzido, as diferenças na composição das soluções escolhidas não acarretaram alterações estatisticamente significantes na capacidade de absorção de fluidos, na distribuição dos receptores AT1 e no citoesqueleto de actina. Porém, quando o tempo de conservação é estendido, a composição da solução utilizada no processo, interfere na qualidade da conservação, acarretando alterações no citoesqueleto de actina, determinando alterações que poderiam implicar em mudanças na função absortiva, sendo que a solução de UW mostrou o melhor desempenho nestas condições experimentais / Abstract: Introduction: Depending on the preservation quality and duration, considering the solution composition and the preservation method, unexpected intercurrences may occur. In consequence, the renal parenchyma and particularly the proximal convoluted tubule (PCT), site where the acute tubular necrosis (NTA) occurs, are susceptible to changes in the organ functional homeostasis during preservation in the post implantation reperfusion period. The PCT reabsorbs approximately 70% of filtered Na+ and H2O, and its apical membrane has specialized cells with microvilli to increase the area of unidirectional solute transport from the lumen to the blood. The major structural component of brush border microvilli is the filamentous F-actin, which has been shown to interact with a variety of transmembrane proteins, including ion transport molecules. This function is regulated by physiological and hormonal parameters, such as angiotensin II (AII) interacting with actin cytoskeleton and associated proteins, mediated mainly through type I receptors (AT1R). After via different signaling pathways having been triggered, the varied functions are started, including fluid absorption (Jv), which is directly related to the actin cytoskeleton. Methods: Fresh (no preserved) and tubules preserved for 1h and 24hrs in Euro-Collins (EC) and Belzer (UW) solutions, treated with AII, losartan and AII+losartan, evaluated by "in vitro" microperfusion technique (fluid absorption (Jv=nl. min-1. mm-1), and by immunohistochemical technique (AT1 receptor measurement and actin cytoskeleton). Results: a) Our results showed that AII (10-12M) (physiological concentration) stimulates fluid absorption (Jv), which is reduced with losartan (10-6M) in fresh PCT, such as PCT preserved for 1h in EC and for 1-24hrs in UW solutions. There was no fluid absorption (Jv?0) in tubules preserved for 24hrs in EC solution. b) The mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors in fresh tubules (no preserved) showed discreet changes while using drug treatments; however, these differences were not statistically significant. In tubules preserved for 1h in EC and UW, the mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors increased in the group with no drug treatment, when compared with tubules treated with AII, losartan and AII+losartan. However, the mean pixel intensity of AT1 receptors in tubules preserved for 24hrs in both solutions increased in those treated with AII, when compared with other groups, control group, losartan and AII+losartan. c) When we examined actin cytoskeleton of fresh tubules (no preserved), comparing groups with no drug treatment and those treated with AII, losartan or AII+losartan, we verified that the variation in the mean pixel intensity of actin cytoskeleton, there was no difference statistically significant. However, we verified a greater cohesion in the actin filaments in tubules treated with AII. In tubules preserved in EC for 1h and UW for 1-24hrs there was a uniform distribution of actin filaments. However, it was verified disorganization in all groups (AII, losartan, AII+losartan) in tubules preserved for 24hrs in EC solution, showing that the organ preservation in this solution was not adjusted. Conclusion: Based on these data, we verified that when PCT preservation was carried out for a reduced time (1h), the differences in the composition of the chosen solutions were not significant; however, when the preservation time was extended, the composition of the solution used in the process affected the preservation quality and altered the actin cytoskeleton, determining alterations that could imply in changes in its absorptive functions. The UW solution showed better performance in these experimental conditions / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

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