Thesis (Ph. D.)--Cornell University, August, 2008. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 116-140).

A resistência tubular renal tem sido estudada a fim de se ampliar a compreensão da fisiopatologia da Insuficiência renal aguda (IRA). A isquemia renal induz à resistência a um subseqüente insulto isquêmico sendo que os mecanismos de resistência parecem depender de alterações celulares. O p21 é um inibidor do ciclo celular, o qual pode ser induzido por radicais livres de oxigênio e parece ter um efeito protetor na IRA isquêmica. O objetivo deste estudo é avaliar o papel do p21 e do estresse oxidativo em modelo de resistência adquirida após episódio de IRA isquêmica, e em túbulos proximais isolados após isquemia. Ratos Wistar foram divididos em 3 grupos: grupo 1- sham, grupo 2- submetido a procedimento sham e após 2 dias submetido à isquemia de 45 min e grupo 3- submetido à isquemia de 45 min e após 2 dias submetido à segunda isquemia de 45 min. Os valores de uréia plasmática (114±60 vs. 136±44 mg/dL, n.s.), a creatinina sérica (0,86±0,2 vs. 0,98±0,1mg/dL, n.s.) e o clearance de creatinina (0,21±0,1vs. 0,24±0,1mL/min/100g, n.s.), avaliados 48 h após o segundo procedimento (Dia 4), foram semelhantes entre os grupos 2 e 3. O tempo de recuperação da IRA também foi semelhante entre os grupos 2 e 3. A histologia mostrou necrose tubular aguda aparentemente de grau semelhante entre os grupos 2 e 3. O infiltrado linfocitário foi semelhante entre os 3 grupos, entretanto houve aumento no infiltrado de macrófagos no grupo 3. Foi observado aumento na proliferação celular no grupo 2 e grupo 3, quando comparados ao grupo 1(125±28 cél./mm2, p<0,05), entretanto, a proliferação foi mais intensa no grupo 2 (1.262±440 cél /mm2) que no grupo 3 (653±300 cél /mm2, p<0,05 vs. group 2). O grau de apoptose encontrado foi semelhante entre o grupo 2 e o grupo 3. Houve aumento na expressão do p21 apenas no grupo 3 sendo que esta expressão foi semelhante nos grupos 1 e 2. Foi estudada também a resistência celular em túbulos proximais (TP) isolados de ratos normais (grupo Controle) e ratos submetidos à isquemia de 35 min, 24 h antes do estudo (grupo Isquemia). TP do grupo Isquemia foram susceptíveis à hipóxia, porém, resistentes à lesão de reoxigenação. Além disto, apresentaram menor produção de hidroperóxidos. Portanto, a resistência renal isquêmica aparentemente está associada a mecanismos celulares, o estresse oxidativo e o aumento na expressão do p21 são possíveis mediadores destes mecanismos. / Renal tubular resistance has been studied for the understanding of ischemic acute renal failure (ARF). Subsequent ischemic episodes may induce renal resistance whose mechanisms seem to be related to cell alterations. P21 is a cell cycle inhibitor that may be induced by oxygen free radicals and may have a protective effect in ischemic ARF. This study aimed at evaluating the role of oxidative stress and p21 on tubular resistance in isolated renal tubules and in a model of acquired resistance after renal ischemia. Wistar rats were divided into 3 groups: group 1 - sham; group 2 - submitted to sham procedure and after 2 days submitted to 45 min ischemia and group 3 - submitted to ischemia of 45 min followed by a second 45 min ischemia after 2 days. Plasma urea levels (114±60 vs. 136±44 mg/dL), serum creatinine (0.86±0.2 vs. 0.98±0.1mg/dL) and creatinine clearance (0.21±0.1vs. 0.24±0.1mL/min/100g.) evaluated at 48 hours after the second procedure were similar between groups 2 and 3 (all NS). ARF recovery time was also similar between groups 2 and 3. Histology disclosed the same degree of acute tubular necrosis between groups 2 and 3. Lymphocytes infiltrate was similar among all groups whereas macrophages infiltrate was greater in group 3. Enhanced cell proliferation was observed in groups 2 and 3 when compared with group 1 (125±28 cel/mm2, p<0.05), however it was greater in group 2 (1,262±440 cel/mm2) than group 3 (653±300 cel/mm2, p<0.05 vs. group 2). Degree of apoptosis was similar between groups 2 and 3. The p21 expression was increased only in group 3 whereas it was similar in groups 1 and 2. Cell resistance was also evaluated in isolated renal proximal tubules (PT) from control and ischemia groups. In the latter group, animals were submitted to 35 min ischemia and PT were isolated one day later. PT from the ischemia group were sensitive to hypoxia but resistant to reoxygenation injury which was followed by lower hydroperoxides production. In conclusion, renal resistance obtained by an ischemia was associated with cell mechanisms involving oxidative stress and increased p21 expression as mediators of this protection.

O peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) é um hormônio incretina secretado pelas células L do trato gastrointestinal e liberado imediatamente após a ingestão de alimento. O GLP-1 estimula a secreção de insulina pós-prandial moderando a elevação precoce da glicose no sangue. Embora primariamente envolvido na homeostase da glicose, o GLP-1 é capaz de induzir a diurese e natriurese, quando administrado em doses farmacológicas em humanos e em roedores. Estudos prévios do nosso laboratório demonstraram que o mecanismo de ação renal do GLP-1, bem como de agonistas sintéticos do receptor GLP-1R, envolve o aumento do fluxo plasmático renal (FPR) e do ritmo de filtração glomerular (RFG) bem como a diminuição da reabsorção de sódio dependente da isoforma 3 do trocador Na?/H? (NHE3) em túbulo proximal renal. Entretanto, até o momento, nenhum estudo investigou se o GLP-1 endógeno exerce efeitos sobre o manuseio renal de sal e água, nem o seu papel fisiológico sobre a regulação da atividade do NHE3. Portanto, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese que o GLP-1 endógeno modula a função renal de ratos, ao menos em parte, via inibição da atividade do NHE3 em túbulo renal. Para este fim, ratos Wistar (2-3 meses de idade) foram devidamente anestesiados, submetidos à traqueostomia e tiveram a veia jugular e a bexiga canuladas para infusão de uma solução contendo 100 ug/kg/min do antagonista do receptor GLP-1R exendin-9 (Ex-9, 40 uL/min) por um período de 30 minutos e para a coleta de urina, respectivamente. A infusão sistêmica de Ex-9 diminuiu a concentração de AMPc urinário e atividade da PKA cortical renal consistente com o bloqueio da sinalização deflagrada pela interação GLP-1/GLP-1R no rim. Além disso, a administração sistêmica de Ex-9 reduziu a diurese, natriurese, RFG, FPR, clearance de lítio e pH urinário. Em experimentos de microperfusão estacionária in vivo, não foram observadas diferenças no fluxo de bicarbonato dependente de NHE3 entre os túbulos proximais perfundidos com exendin-9 (2 uM) e os túbulos perfundidos com solução controle. No entanto, a perfusão tubular proximal com Ex-9 foi capaz de bloquear completamente as ações inibitórias do GLP-1 (20 nM) sobre a atividade do NHE3. Por outro lado, a infusão sistêmica do Ex-9 reduziu os níveis de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a fosforilação por PKA localizado na região C-terminal do NHE3, e que está associado à inibição da atividade de troca Na+/H+ mediada por este transportador. Baseando-se nos achados que a infusão sistêmica do Ex-9 aumenta a reabsorção de sódio e secreção de H?, reduz o clearance do lítio e os diminui os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 são consistentes com um aumento na atividade deste transportador na ausência/redução da sinalização mediada pela interação do GLP-1 endógeno com seu receptor no rim. Por sua vez, o fato do Ex-9 não afetar a atividade do NHE3 sob as condições experimentais da microperfusão estacionária in vivo é condizente com o fato do GLP-1 não ser sintetizado no néfron e sugere fortemente que é o GLP-1 filtrado que se liga ao seu receptor no túbulo proximal renal resultando na diminuição da reabsorção de bicarbonato de sódio mediada pelo NHE3. Em conjunto, estes resultados sugerem que o GLP-1 endógeno exerce efeito tônico sobre o manuseio renal de sódio e água, mediando portanto, uma relação funcional entre a homeostase glicêmica e volêmica / The glucagon like peptide-1 (GLP-1) is an incretin hormone secreted by the L-cells of the gastrointestinal tract and released immediately after ingestion of food. GLP-1 stimulates postprandial insulin secretion moderating early increase in blood glucose. Although primarily involved in glucose homeostasis, GLP-1 is capable of inducing diuresis and natriuresis when administered in pharmacologic doses in humans and rodents. Previous studies from our laboratory have shown that the renal mechanism of action of GLP-1 and synthetic agonists of GLP-1R receptor, involves an increase of renal plasma flow (RPF) and glomerular filtration rate (GFR) as well a decrease in reabsorption of sodium mediated by the Na? / H? exchanger (NHE3) isoform 3 in the renal proximal tubule. However, to date, no study has investigated whether endogenous GLP-1 exerts effects on the renal handling of salt and water, or its physiological role in the regulation of the activity of NHE3. Therefore, the aim of this study was to test the hypothesis that endogenous GLP-1 modulates renal function in rats, at least in part, via inhibition of the NHE3 in renal tubule. To this end, male Wistar rats (2-3 months old) were properly anesthetized, tracheostomized and the jugular vein and the bladder were cannulated to the infusion of a solution containing 100 ug / kg / min GLP-1R antagonist receiver exendin-9 (Ex-9, 40 uL/min) for a period of 30 minutes and to collect urine, respectively. Systemic infusion of Ex-9 reduced the urinary concentration of cAMP and the renal cortical PKA activity, consistent with the blockage of the signal triggered by the interaction of GLP-1 / GLP-1R in the kidney. Furthermore, systemic administration of ex-9 reduced diuresis, natriuresis, GFR, RPF, lithium clearance and urinary pH. In experiments of in vivo stationary microperfusion, no differences were observed in the NHE3-mediated net bicarbonate flow between proximal tubules perfused with exendin-9 (2 mM) and perfused tubules with control solution. However, the tubular proximal perfusion with Ex-9 was able to completely block the inhibitory actions of GLP-1 (20 nM) on the activity of NHE3. On the other hand, systemic infusion of Ex-9 reduced phosphorylation levels of serine 552, a consensus site for phosphorylation by PKA located in the C-terminal region of NHE3, which is associated with inhibition of exchange activity of Na+/H+ mediated by this transporter. Collectively, the findings that systemic infusion of Ex-9 increases sodium reabsorption and secretion of H+, reduces the lithium clearance and decreases the NHE3 phosphorylation at serine 552 levels are consistent with the idea that NHE3 activity is upregulated in the absence/reduction of the signaling cascade mediated by the interaction of the endogenous GLP-1 with its receptor in the kidney. In turn, the fact Ex-9 does not affect the activity of NHE3 under the experimental conditions of stationary microperfusion in vivo is consistent with the fact that GLP-1 is not synthesized in the nephron. Besides, it strongly suggests that is the filtrated GLP-1 that binds to its receptor in renal proximal tubule, resulting in a decrease in NHE3-mediated sodium bicarbonate reabsorption. Taken together, these results suggest that endogenous GLP-1 exerts a tonic effect on renal sodium and water handling, mediating therefore a functional relationship between volume and glucose homeostasis

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Apesar de muito se discutir sobre os efeitos citotÃxicos dos venenos ofÃdicos, pouco ainda à conhecido sobre os mecanismos de aÃÃo sobre as diversas cÃlulas, e em especial, sobre as cÃlulas renais. No caso particular da citotoxicidade dos venenos crotÃlicos, tem-se postulado a participaÃÃo de diversos metabÃlitos da hidrÃlise de lipÃdios de membrana, e, mais recentemente, da disfunÃÃo mitocondrial. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno da Crotalus durissus terrificus sobre rim isolado de rato assim como estudar a toxicidade e as alteraÃÃes da funÃÃo mitocondrial induzidas pelas FLA2s de pÃncreas de porco (PFLA2) e de veneno da C. d. terrificus (VSFLA2) em suspensÃes de tÃbulos proximais (TP). No rim isolado foi observado aumento no fluxo urinÃrio, no ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) e na pressÃo de perfusÃo (PP) enquanto ocorreram decrÃscimos nos percentuais de transporte total de sÃdio (%TNa+), de potÃssio (%TK+) e de cloreto (%TCl-). Na anÃlise histopatolÃgica foi observada a deposiÃÃo de material proteinÃceo nos tÃbulos de rins perfundidos com FLA2. No estudo de suspensÃes de TP tratadas com PFLA2 e com VSFLA2 foi observado que estas induziram injÃria celular, sugerida pelo aumento na liberaÃÃo de lactato desidrogenase (LDH), promoveram aumentos nos nÃveis de Ãcidos graxos nÃo esterificados (AGNE) e diminuÃram o potencial de membrana mitocondrial (&#916;&#936;m), sem, no entanto, alterar os nÃveis de ATP. Em relaÃÃo ao &#916;&#936;m, a PPFLA2 nÃo produziu efeitos nas concentraÃÃes mais elevadas, apesar de ter aumentado, significativamente, na menor concentraÃÃo. As concentraÃÃes mais elevadas da FLA2 crotÃlica, entretanto, induziram um decrÃscimo significativo no &#916;&#936;m. A adiÃÃo de BSA reverteu completamente os efeitos das FLA2s sobre o &#916;&#936;m. No estudo da permeabilidade mitocondrial de transiÃÃo (PMT) foi observado que a PFLA2 e a VSFLA2 promoveram a liberaÃÃo da safranina O e, por entanto, induziu a formaÃÃo de PMT, apesar da leve edema mitocondrial produzido. Conclui-se que as fosfolipases A2 de pÃncreas de porco e do veneno da C. d. terrificus produziram um efeito citotÃxico em preparaÃÃes de tÃbulos proximais evidenciado pelo aumento na liberaÃÃo de LDH, alÃm de promoverem alteraÃÃes no potencial mitocondrial de membrana, o que sugere alteraÃÃo da funÃÃo mitocondrial por essas enzimas. Em rim isolado, foi observado que a FLA2 crotÃlica promoveu alteraÃÃes da funÃÃo renal / Although the increasing interest on biological effects of snake venoms, their cytotoxic as well as their nephrotoxic mechanisms are still unknown. In the particular case of crotalic venoms, it has been postulated the participation of several metabolites from membrane phospholipids hydrolysis and more recently, mitochondrial dysfunction. The present work investigated the renal effects promoted by the phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus venom in the isolated rat kidney. Addition of PLA2 increased UF, GFR and PP, while reducing %TNa+, %TK+ and %TCl-. The histological analysis showed a mild amount of a proteinaceous substance in the renal tubules of kidneys perfused with PLA2. In the present study also showed that the phospholipase A2 isolated from porcine pancreas (PPLA2) and from C d terrificus snake venom (SVPLA2) produced cellular injury suggested by the increase in LDH release and increased nonesterified fatty acid (NEFA) levels from rabbit proximal tubules in suspension. Furthermore, the SVPLA2 induced a decrease in mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) assessed by both JC-1 uptake and safranin O uptake. PPLA2 produced no effects on &#916;&#936;m with the highest concentrations, and an unexpected increase in the group treated with the lowest concentration. Addition of BSA completely reversed the effects induced by phospholipases on &#916;&#936;m. It was observed no changes in cell ATP levels. Finally, to determine whether mitochondrial membrane permeability was affected by PPLA2 and SVPLA2, we measured the change safranin O uptake to assess both changes in mitochondrial volume and in &#916;&#936;m. The latter was affected by both PLA2s although small alterations in the mitochondrial volume were observed. We conclude that the treatment of proximal tubule suspensions with porcine or crotalic PLA2s disturbed the membrane integrity as well as the mitochondrial function. Furthermore, crotalic PLA2 altered renal function in the isolated rat kidney preparation.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 4 uppsatser.

O peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) é um hormônio incretina secretado pelas células L do trato gastrointestinal e liberado imediatamente após a ingestão de alimento. O GLP-1 estimula a secreção de insulina pós-prandial moderando a elevação precoce da glicose no sangue. Embora primariamente envolvido na homeostase da glicose, o GLP-1 é capaz de induzir a diurese e natriurese, quando administrado em doses farmacológicas em humanos e em roedores. Estudos prévios do nosso laboratório demonstraram que o mecanismo de ação renal do GLP-1, bem como de agonistas sintéticos do receptor GLP-1R, envolve o aumento do fluxo plasmático renal (FPR) e do ritmo de filtração glomerular (RFG) bem como a diminuição da reabsorção de sódio dependente da isoforma 3 do trocador Na?/H? (NHE3) em túbulo proximal renal. Entretanto, até o momento, nenhum estudo investigou se o GLP-1 endógeno exerce efeitos sobre o manuseio renal de sal e água, nem o seu papel fisiológico sobre a regulação da atividade do NHE3. Portanto, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese que o GLP-1 endógeno modula a função renal de ratos, ao menos em parte, via inibição da atividade do NHE3 em túbulo renal. Para este fim, ratos Wistar (2-3 meses de idade) foram devidamente anestesiados, submetidos à traqueostomia e tiveram a veia jugular e a bexiga canuladas para infusão de uma solução contendo 100 ug/kg/min do antagonista do receptor GLP-1R exendin-9 (Ex-9, 40 uL/min) por um período de 30 minutos e para a coleta de urina, respectivamente. A infusão sistêmica de Ex-9 diminuiu a concentração de AMPc urinário e atividade da PKA cortical renal consistente com o bloqueio da sinalização deflagrada pela interação GLP-1/GLP-1R no rim. Além disso, a administração sistêmica de Ex-9 reduziu a diurese, natriurese, RFG, FPR, clearance de lítio e pH urinário. Em experimentos de microperfusão estacionária in vivo, não foram observadas diferenças no fluxo de bicarbonato dependente de NHE3 entre os túbulos proximais perfundidos com exendin-9 (2 uM) e os túbulos perfundidos com solução controle. No entanto, a perfusão tubular proximal com Ex-9 foi capaz de bloquear completamente as ações inibitórias do GLP-1 (20 nM) sobre a atividade do NHE3. Por outro lado, a infusão sistêmica do Ex-9 reduziu os níveis de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a fosforilação por PKA localizado na região C-terminal do NHE3, e que está associado à inibição da atividade de troca Na+/H+ mediada por este transportador. Baseando-se nos achados que a infusão sistêmica do Ex-9 aumenta a reabsorção de sódio e secreção de H?, reduz o clearance do lítio e os diminui os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 são consistentes com um aumento na atividade deste transportador na ausência/redução da sinalização mediada pela interação do GLP-1 endógeno com seu receptor no rim. Por sua vez, o fato do Ex-9 não afetar a atividade do NHE3 sob as condições experimentais da microperfusão estacionária in vivo é condizente com o fato do GLP-1 não ser sintetizado no néfron e sugere fortemente que é o GLP-1 filtrado que se liga ao seu receptor no túbulo proximal renal resultando na diminuição da reabsorção de bicarbonato de sódio mediada pelo NHE3. Em conjunto, estes resultados sugerem que o GLP-1 endógeno exerce efeito tônico sobre o manuseio renal de sódio e água, mediando portanto, uma relação funcional entre a homeostase glicêmica e volêmica / The glucagon like peptide-1 (GLP-1) is an incretin hormone secreted by the L-cells of the gastrointestinal tract and released immediately after ingestion of food. GLP-1 stimulates postprandial insulin secretion moderating early increase in blood glucose. Although primarily involved in glucose homeostasis, GLP-1 is capable of inducing diuresis and natriuresis when administered in pharmacologic doses in humans and rodents. Previous studies from our laboratory have shown that the renal mechanism of action of GLP-1 and synthetic agonists of GLP-1R receptor, involves an increase of renal plasma flow (RPF) and glomerular filtration rate (GFR) as well a decrease in reabsorption of sodium mediated by the Na? / H? exchanger (NHE3) isoform 3 in the renal proximal tubule. However, to date, no study has investigated whether endogenous GLP-1 exerts effects on the renal handling of salt and water, or its physiological role in the regulation of the activity of NHE3. Therefore, the aim of this study was to test the hypothesis that endogenous GLP-1 modulates renal function in rats, at least in part, via inhibition of the NHE3 in renal tubule. To this end, male Wistar rats (2-3 months old) were properly anesthetized, tracheostomized and the jugular vein and the bladder were cannulated to the infusion of a solution containing 100 ug / kg / min GLP-1R antagonist receiver exendin-9 (Ex-9, 40 uL/min) for a period of 30 minutes and to collect urine, respectively. Systemic infusion of Ex-9 reduced the urinary concentration of cAMP and the renal cortical PKA activity, consistent with the blockage of the signal triggered by the interaction of GLP-1 / GLP-1R in the kidney. Furthermore, systemic administration of ex-9 reduced diuresis, natriuresis, GFR, RPF, lithium clearance and urinary pH. In experiments of in vivo stationary microperfusion, no differences were observed in the NHE3-mediated net bicarbonate flow between proximal tubules perfused with exendin-9 (2 mM) and perfused tubules with control solution. However, the tubular proximal perfusion with Ex-9 was able to completely block the inhibitory actions of GLP-1 (20 nM) on the activity of NHE3. On the other hand, systemic infusion of Ex-9 reduced phosphorylation levels of serine 552, a consensus site for phosphorylation by PKA located in the C-terminal region of NHE3, which is associated with inhibition of exchange activity of Na+/H+ mediated by this transporter. Collectively, the findings that systemic infusion of Ex-9 increases sodium reabsorption and secretion of H+, reduces the lithium clearance and decreases the NHE3 phosphorylation at serine 552 levels are consistent with the idea that NHE3 activity is upregulated in the absence/reduction of the signaling cascade mediated by the interaction of the endogenous GLP-1 with its receptor in the kidney. In turn, the fact Ex-9 does not affect the activity of NHE3 under the experimental conditions of stationary microperfusion in vivo is consistent with the fact that GLP-1 is not synthesized in the nephron. Besides, it strongly suggests that is the filtrated GLP-1 that binds to its receptor in renal proximal tubule, resulting in a decrease in NHE3-mediated sodium bicarbonate reabsorption. Taken together, these results suggest that endogenous GLP-1 exerts a tonic effect on renal sodium and water handling, mediating therefore a functional relationship between volume and glucose homeostasis

Orientador: Jose Francisco Figueiredo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertels_IvoneMedeirosVieira_D.pdf: 6733194 bytes, checksum: c8a7c3bcca8ad5732334627b49957dcc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: A qualidade da conservação obtida em um órgão e a duração do armazenamento seguro são dependentes do tipo de solução e tempo de conservação, estando sujeitas a intercorrências imprevisíveis. Em virtude disso, o parênquima renal e, particularmente, o túbulo contornado proximal (TCP), local onde ocorre necrose tubular aguda (NTA), são susceptíveis às mudanças na homeostase funcional do órgão, durante a conservação e durante a reperfusão pós-implante. O TCP reabsorve cerca de 70% de Na+ e H2O filtrados; sua membrana apical tem células especializadas com microvilosidades para aumentar a área de transporte unidirecional de solutos do lúmen para o sangue. O principal componente estrutural da bordadura em escova, filamentos de F-actina, interage com uma variedade de proteínas transmembranas, inclusive moléculas transportadoras de íons. Esta função é regulada por parâmetros fisiológicos e hormonais, sendo a Angiotensina II (AII) uma das principais envolvidas com o citoesqueleto de actina e proteínas associadas, mediada principalmente por seus receptores AT1. Métodos: Neste trabalho, túbulos isolados de fragmentos frescos e de fragmentos conservados por períodos de 1 e 24h nas soluções de Euro - Collins (ECO) e de Belzer (UW) foram tratados com AII, losartan e AII+losartan, para medida do volume de absorção de fluido (Jv=nl. min_1. mm-1 (microperfusão in vitro), e medida da intensidade (média) de pixel da fluorescência dos receptores AT1 e do citoesqueleto de actina (imunoistoquímica). Resultados: a) Demonstrou-se que AII (10-12M) estimula absorção fluida (Jv), que é diminuída com losartan (10-6M) em TCP frescos e também em TCP conservados em soluções de ECO 1h e UW 1-24h. Em túbulos conservados 24h em ECO, não houve absorção de fluidos. b) A média da intensidade de pixel de fluorescência dos receptores AT1 em túbulos frescos (sem conservação) apresentou discreta variação entre os grupos não estatisticamente significante. Em túbulos conservados 1h com ECO e UW, a média da intensidade de pixel de receptores AT1 estava aumentada no grupo sem drogas, quando comparados aos tratados com AII, losartan e AII+losartan. Entretanto, em túbulos conservados 24h, ambas as soluções, houve aumento na média de intensidade do pixel de receptores AT1, no grupo tratado com AII, quando comparados aos demais grupos. c) O citoesqueleto de actina em túbulos frescos (sem conservação) não mostrou variação estatisticamente significante na média de intensidade de pixel entre os grupos (AII, losartan ou AII+losartan). No entanto, verificamos uma maior coesão entre os filamentos de actina de túbulos tratados com AII. A distribuição dos filamentos de actina em túbulos conservados em ECO 1h e UW 1 e 24h, mostrou-se uniforme, sem diferenças entre os grupos. Entretanto, em túbulos conservados em ECO 24h (tratamentos AII, losartan, AII+losartan) foi verificada alteração do citoesqueleto de actina. Conclusão: Baseados nestes dados, verificamos que, na conservação do TCP realizada por tempo reduzido, as diferenças na composição das soluções escolhidas não acarretaram alterações estatisticamente significantes na capacidade de absorção de fluidos, na distribuição dos receptores AT1 e no citoesqueleto de actina. Porém, quando o tempo de conservação é estendido, a composição da solução utilizada no processo, interfere na qualidade da conservação, acarretando alterações no citoesqueleto de actina, determinando alterações que poderiam implicar em mudanças na função absortiva, sendo que a solução de UW mostrou o melhor desempenho nestas condições experimentais / Abstract: Introduction: Depending on the preservation quality and duration, considering the solution composition and the preservation method, unexpected intercurrences may occur. In consequence, the renal parenchyma and particularly the proximal convoluted tubule (PCT), site where the acute tubular necrosis (NTA) occurs, are susceptible to changes in the organ functional homeostasis during preservation in the post implantation reperfusion period. The PCT reabsorbs approximately 70% of filtered Na+ and H2O, and its apical membrane has specialized cells with microvilli to increase the area of unidirectional solute transport from the lumen to the blood. The major structural component of brush border microvilli is the filamentous F-actin, which has been shown to interact with a variety of transmembrane proteins, including ion transport molecules. This function is regulated by physiological and hormonal parameters, such as angiotensin II (AII) interacting with actin cytoskeleton and associated proteins, mediated mainly through type I receptors (AT1R). After via different signaling pathways having been triggered, the varied functions are started, including fluid absorption (Jv), which is directly related to the actin cytoskeleton. Methods: Fresh (no preserved) and tubules preserved for 1h and 24hrs in Euro-Collins (EC) and Belzer (UW) solutions, treated with AII, losartan and AII+losartan, evaluated by "in vitro" microperfusion technique (fluid absorption (Jv=nl. min-1. mm-1), and by immunohistochemical technique (AT1 receptor measurement and actin cytoskeleton). Results: a) Our results showed that AII (10-12M) (physiological concentration) stimulates fluid absorption (Jv), which is reduced with losartan (10-6M) in fresh PCT, such as PCT preserved for 1h in EC and for 1-24hrs in UW solutions. There was no fluid absorption (Jv?0) in tubules preserved for 24hrs in EC solution. b) The mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors in fresh tubules (no preserved) showed discreet changes while using drug treatments; however, these differences were not statistically significant. In tubules preserved for 1h in EC and UW, the mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors increased in the group with no drug treatment, when compared with tubules treated with AII, losartan and AII+losartan. However, the mean pixel intensity of AT1 receptors in tubules preserved for 24hrs in both solutions increased in those treated with AII, when compared with other groups, control group, losartan and AII+losartan. c) When we examined actin cytoskeleton of fresh tubules (no preserved), comparing groups with no drug treatment and those treated with AII, losartan or AII+losartan, we verified that the variation in the mean pixel intensity of actin cytoskeleton, there was no difference statistically significant. However, we verified a greater cohesion in the actin filaments in tubules treated with AII. In tubules preserved in EC for 1h and UW for 1-24hrs there was a uniform distribution of actin filaments. However, it was verified disorganization in all groups (AII, losartan, AII+losartan) in tubules preserved for 24hrs in EC solution, showing that the organ preservation in this solution was not adjusted. Conclusion: Based on these data, we verified that when PCT preservation was carried out for a reduced time (1h), the differences in the composition of the chosen solutions were not significant; however, when the preservation time was extended, the composition of the solution used in the process affected the preservation quality and altered the actin cytoskeleton, determining alterations that could imply in changes in its absorptive functions. The UW solution showed better performance in these experimental conditions / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

A resistência tubular renal tem sido estudada a fim de se ampliar a compreensão da fisiopatologia da Insuficiência renal aguda (IRA). A isquemia renal induz à resistência a um subseqüente insulto isquêmico sendo que os mecanismos de resistência parecem depender de alterações celulares. O p21 é um inibidor do ciclo celular, o qual pode ser induzido por radicais livres de oxigênio e parece ter um efeito protetor na IRA isquêmica. O objetivo deste estudo é avaliar o papel do p21 e do estresse oxidativo em modelo de resistência adquirida após episódio de IRA isquêmica, e em túbulos proximais isolados após isquemia. Ratos Wistar foram divididos em 3 grupos: grupo 1- sham, grupo 2- submetido a procedimento sham e após 2 dias submetido à isquemia de 45 min e grupo 3- submetido à isquemia de 45 min e após 2 dias submetido à segunda isquemia de 45 min. Os valores de uréia plasmática (114±60 vs. 136±44 mg/dL, n.s.), a creatinina sérica (0,86±0,2 vs. 0,98±0,1mg/dL, n.s.) e o clearance de creatinina (0,21±0,1vs. 0,24±0,1mL/min/100g, n.s.), avaliados 48 h após o segundo procedimento (Dia 4), foram semelhantes entre os grupos 2 e 3. O tempo de recuperação da IRA também foi semelhante entre os grupos 2 e 3. A histologia mostrou necrose tubular aguda aparentemente de grau semelhante entre os grupos 2 e 3. O infiltrado linfocitário foi semelhante entre os 3 grupos, entretanto houve aumento no infiltrado de macrófagos no grupo 3. Foi observado aumento na proliferação celular no grupo 2 e grupo 3, quando comparados ao grupo 1(125±28 cél./mm2, p<0,05), entretanto, a proliferação foi mais intensa no grupo 2 (1.262±440 cél /mm2) que no grupo 3 (653±300 cél /mm2, p<0,05 vs. group 2). O grau de apoptose encontrado foi semelhante entre o grupo 2 e o grupo 3. Houve aumento na expressão do p21 apenas no grupo 3 sendo que esta expressão foi semelhante nos grupos 1 e 2. Foi estudada também a resistência celular em túbulos proximais (TP) isolados de ratos normais (grupo Controle) e ratos submetidos à isquemia de 35 min, 24 h antes do estudo (grupo Isquemia). TP do grupo Isquemia foram susceptíveis à hipóxia, porém, resistentes à lesão de reoxigenação. Além disto, apresentaram menor produção de hidroperóxidos. Portanto, a resistência renal isquêmica aparentemente está associada a mecanismos celulares, o estresse oxidativo e o aumento na expressão do p21 são possíveis mediadores destes mecanismos. / Renal tubular resistance has been studied for the understanding of ischemic acute renal failure (ARF). Subsequent ischemic episodes may induce renal resistance whose mechanisms seem to be related to cell alterations. P21 is a cell cycle inhibitor that may be induced by oxygen free radicals and may have a protective effect in ischemic ARF. This study aimed at evaluating the role of oxidative stress and p21 on tubular resistance in isolated renal tubules and in a model of acquired resistance after renal ischemia. Wistar rats were divided into 3 groups: group 1 - sham; group 2 - submitted to sham procedure and after 2 days submitted to 45 min ischemia and group 3 - submitted to ischemia of 45 min followed by a second 45 min ischemia after 2 days. Plasma urea levels (114±60 vs. 136±44 mg/dL), serum creatinine (0.86±0.2 vs. 0.98±0.1mg/dL) and creatinine clearance (0.21±0.1vs. 0.24±0.1mL/min/100g.) evaluated at 48 hours after the second procedure were similar between groups 2 and 3 (all NS). ARF recovery time was also similar between groups 2 and 3. Histology disclosed the same degree of acute tubular necrosis between groups 2 and 3. Lymphocytes infiltrate was similar among all groups whereas macrophages infiltrate was greater in group 3. Enhanced cell proliferation was observed in groups 2 and 3 when compared with group 1 (125±28 cel/mm2, p<0.05), however it was greater in group 2 (1,262±440 cel/mm2) than group 3 (653±300 cel/mm2, p<0.05 vs. group 2). Degree of apoptosis was similar between groups 2 and 3. The p21 expression was increased only in group 3 whereas it was similar in groups 1 and 2. Cell resistance was also evaluated in isolated renal proximal tubules (PT) from control and ischemia groups. In the latter group, animals were submitted to 35 min ischemia and PT were isolated one day later. PT from the ischemia group were sensitive to hypoxia but resistant to reoxygenation injury which was followed by lower hydroperoxides production. In conclusion, renal resistance obtained by an ischemia was associated with cell mechanisms involving oxidative stress and increased p21 expression as mediators of this protection.

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

A hipertensão arterial essencial é caracterizada pela elevação crônica da pressão arterial e representa o principal fator de risco para doenças cardiovasculares e renais. O rim participa do controle da pressão arterial e alterações intrínsecas no manuseio renal de sódio desempenham papel importante na patogênese da hipertensão essencial. Os túbulos proximais renais são responsáveis pela reabsorção da maior parte do sódio filtrado nos glomérulos e a maior parte da reabsorção de sódio neste segmento faz-se através da troca de Na+ por H+ em membrana apical, mediada pela isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3). Entretanto, os dados existentes referentes à modulação renal do NHE3 em modelos de hipertensão são ainda conflitantes. Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações funcionais do trocador Na+/H+ NHE3 em túbulo proximal renal na linhagem SHR no estágio de préhipertensão (5 semanas) e de hipertensão (14 semanas) e investigar se estas alterações são acompanhadas de alterações na atividade e na expressão da proteína cinase A (PKA) e de proteínas fosfatase-1 (PP1). Por meio de microperfusão estacionária in vivo mediu-se a atividade do NHE3 em túbulo proximal e verificou-se que a reabsorção de bicarbonato foi reduzida em 62 ± 6 % (P < 0,001) na transição do J-SHR para o A-SHR enquanto foi aumentada em 113 ± 10 % (P < 0,001) na transição entre o J-WKY e o A-WKY. A atividade estimulada do NHE3 em J-SHR é decorrente da redistribuição do NHE3 do domínio intermicrovilar (IMV) para o domínio das microvilosidades (MMV) e do baixo nível de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a PKA. Por outro lado, durante a fase de hipertensão, a atividade diminuída do NHE3 deve-se à sua redistribuição para o IMV e ao aumento da fosforilação na serina 552. Para testar a hipótese de que os níveis de fosforilação do NHE3 estariam aumentados em túbulo proximal de SHR adulto devido ao aumento da atividade da PKA e/ou à diminuição na atividade da PP1, foram avaliados tanto os níveis de fosforilação quanto a atividade do NHE3 em SHR jovens e adultos em resposta ao 6MB-cAMP (análogo ao cAMP que ativa especificamente a PKA). O JSHR apresentou um aumento tanto nos níveis de fosforilação da serina 552 (179 ± 14 %, P < 0,001) quanto nos de inibição da atividade (65 ± 10 %, P < 0,001) do NHE3 em relação ao J-SHR em resposta ao 6MB-cAMP. Já no A-SHR, a fosforilação da serina 552 aumentou moderadamente (36 ± 4 %, P < 0,01), assim como inibiu moderadamente (23 ± 9 %, P < 0,05) a atividade do NHE3 em resposta ao 6MBcAMP. Adicionalmente, verificou-se que não houve alteração da atividade da PKA entre os animais nem ao longo da idade e nem entre as linhagens. Por sua vez, o JSHR apresentou maior atividade da PP1 que o A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0,01). Além disso, houve uma diminuição na expressão da PP1? no ASHR (32 ± 8 %, P < 0,01) quando comparado ao J-SHR. Os dados sugerem que o NHE3 é diferencialmente regulado antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR por mecanismos que envolvem modificações pós-transcricionais e distribuição subcelular. Além do mais, a regulação diferencial dos níveis de fosforilação do NHE3 tubular proximal antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR é devida, provavelmente, a alterações na atividade e na expressão da PP1 / Essential hypertension is characterized by chronic elevation of blood pressure and represents the major risk factor for cardiovascular and renal diseases. The kidney participates in the blood pressure control and intrinsic changes in renal sodium handling play an important role in the pathogenesis of essential hypertension. The renal proximal tubule is responsible for reabsorption of the great majority of sodium that is filtered by the glomerulus and the principal apical membrane mechanism for sodium reabsorption in this nephron is Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3)- mediated Na+/H+ exchange. However, conflicting data have been reported with regard to NHE3 modulation in experimental models of hypertension. This study aimed to evaluate the possible functional changes of the Na+/H+ exchanger NHE3 in the renal proximal tubule of SHR both at the pre-hypertensive (5 weeks) and at hypertensive (14 weeks) stages and to investigate whether these changes were accompanied by changes in the activity and/or expression of protein kinase A (PKA) and protein phosphatase 1 (PP1). Proximal tubule NHE3 activity was measured by means of stationary microperfusion. Bicarbonate reabsorption was found to be decreased by 62 ± 6 % (P < 0.001) in the transition from youth to adulthood in SHR (Y-SHR to A-SHR), whereas in the transition from Y-WKY to A-WKY it increased by 113 ± 10 % (P < 0.001). Stimulated NHE3 activity in Y-SHR was due to redistribution of NHE3 from intermicrovilar domain (IMV) to microvilar domain (MMV) and to a lower level of serine 552 phosphorylation, a consensus site for PKA. Conversely, during the hypertensive stage, decreased NHE3 activity was due to increased redistribution of NHE3 to the IMV domain and increased phosphorylation at serine 552. To test the hypothesis that the increased levels of NHE3 phosphorylation in the proximal tubule of adult SHR were due to increased PKA activity and/or decreased PP1 activity, it was evaluated both phosphorylation levels and activity of NHE3 in young and adult SHR in response to 6MB-cAMP (an cAMP analog that specifically activates PKA). Y-SHR showed an increase both in the phosphorylation levels at serine 552 (179 ± 14 %, P < 0.001) and in the inhibition of NHE3 transport activity (65 ± 10 %, P < 0.001) compared to Y-SHR in response to 6MB-cAMP. With respect to A-SHR, the phosphorylation of serine 552 was slightly increased (36 ± 4 %, P < 0.01) and NHE3 activity was mildly inhibited (23 ± 9 %, P < 0.05) in response to 6MB-cAMP. Additionally, PKA activity remained unchanged with both age and strain. Nevertheless, Y-SHR exhibited higher PP1 activity than A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0.01). Furthermore, PP1? expression was decreased in the renal cortex of A-SHR (32 ± 8 %, P < 0.01) compared to Y-SHR. Taken together, these data suggest that NHE3 is differentially regulated before and after development of hypertension in SHR by mechanisms involving post-translational modifications and subcellular distribution. Moreover, the differential regulation of proximal tubule NHE3 phosphorylation levels before and after development of hypertension in SHR is most likely due to changes on the activity and expression of PP1