O controle da eficiência de bacterinas antileptospirose de uso animal é o teste de potência com desafio em hamsters, contudo, na atualidade, tem sido estimulada a busca de alternativas que dispensem o uso de animais de laboratório. O teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICLIV) tem sido proposto como possível alternativa. O presente trabalho empregou os testes de ICLIV, soroaglutinação microscópica (SAM) e ELISA anti IgG para avaliar a intensidade e a duração da imunidade passiva em leitões em aleitamento e ativa em matrizes suínas e leitões desmamados imunizados com bacterina experimental antileptospirose aprovada no teste de potência em hamster. Foi produzida uma bacterina experimental antileptospirose com estirpe patogênica de Leptospira interrogans, sorovar Kennewicki, estirpe Pomona Fromm (LPF), padronizada para conter 109 leptospiras por mL e associada ao adjuvante de hidróxido de alumínio na proporção de 10% do volume da dose final. Para a avaliação da eficácia da concentração mínima de leptospiras a ser utilizada na bacterina, diluições seriadas de razão dez de cultivo de leptospiras variando de 105 a 109 leptospiras/mL, foram submetidas ao teste de potência com desafio em hamsters (Experimento A), apenas a bacterina produzida na concentração de 109 leptospiras/mL foi capaz de proteger os hamsters contra a infecção induzida pela estirpe LPF, quando a vacina foi testada na diluição de 1:800, critério internacional de aprovação. A bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi submetida ao teste de potência em hamsters (Experimento B), imunizados com a vacina pura e em diluições seriadas de razão dois (200 a 25600). A bacterina foi aprovada no teste de desafio em hamster até a diluição de 1:6400. O controle do inóculo de desafio foi constituído por 100 DL50. Fêmeas suínas que nunca haviam sido vacinadas contra a leptospirose e que foram não reagentes no teste de soroaglutinação microscópica aplicado a leptospirose efetuado com 24 estirpes de referência e no teste ICLIV com a estirpe LPF (Experimento 1), receberam duas aplicações intervaladas de 30 dias e um reforço aos 210 da primeira dose da bacterina pura e em diluições seriadas de razão dois (400 a 3200). Estes animais foram 16 monitorados com colheitas de sangue efetuadas a cada 30 dias. Os picos máximos de anticorpos avaliados pelos testes de SAM e de ICLIV foram observados aos 30 dias da segunda aplicação da vacina, com maior magnitude para a vacina pura, contudo aos 120 dias da segunda aplicação da vacina houve um declínio acentuado nos níveis de anticorpos. Para encontrar um melhor intervalo entre as imunizações (Experimento 2), fêmeas suínas receberam duas aplicações da bacterina pura intervaladas de 30 dias e o reforço aos 150 da primeira dose. A redução do intervalo de revacinação após as duas doses iniciais determinou a persistência dos títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes com níveis sempre superiores a 0,4 log. Nos leitões em aleitamento filhos das matrizes imunizadas com bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi constatada a transferência de imunidade passiva, confirmada pelos títulos de anticorpos aglutinantes detectáveis no quinto dia de vida e de neutralizantes no quinto e décimo dia de vida. Nos ensaios realizados em leitões desmamados imunizados com uma série de diluições de razão dez variando de a 109 leptospiras/mL os picos máximos de anticorpos foram observados aos 30 dias da segunda imunização, com maior magnitude para a bacterina testada na concentração de 109 leptospiras/mL. Os parâmetros finalmente obtidos foram que matrizes suínas e leitões desmamados, primovacinados com duas aplicações intervaladas de 30 dias da bacterina aprovada no teste de potência com desafio em hamster, apresentaram no teste de ICLIV efetuado aos 60 dias da primo-vacinação, intervalos de títulos de anticorpos (95%) expressos em log variando, respectivamente de (0,87 a 1,35) e de (1,22 a 1,58). Os valores máximos (12.800) para o teste de ELISA anti IgG das matrizes suínas foram obtidos após o reforço efetuado aos 210 dias. / The potency of antileptospirosis bacterins is controlled by in vivo experimental assay performed in hamsters; however, nowadays the search for in vitro methodologies that could replace the use of laboratory animals has been stimulated. For this purpose, the In vitro leptospiral growth inhibition test (IVLGIT) has been proposed as an alternative test. In this work, the intensity and duration of the passive immunity in suckling piglets and active immunity in weaned piglets and adult sows were evaluated, after vaccination with an experimental leptospirosis bacterin, which had been approved previously on the potency test in hamsters. The in vitro tests applied to swine sera were the growth inhibition test (IVLGIT), microscopic agglutination (MAT) and anti-IgG ELISA. The bacterin was produced with a pathogenic Leptospira interrogans serovar Kennewicki strain identified as Pomona Fromm (LPF), and added with aluminum hydroxide as adjuvant at a concentration of 10% of the final volume dose. In order to evaluate the efficacy of the minimum concentration of the leptospires to be used in the bacterin, ten-fold serial dilutions of a culture of leptospira varying from 105 to 109 leptospires/mL were submitted to potency-challenge test in hamsters (Trial A). Only the bacterin produced at the concentration of 109 leptospires/mL protected the hamsters against the infection by LPF strain, when the vaccine was tested at the dilution of 1:800, which is the international criterion for the approval. The bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL was submitted to the potency test in hamsters (Trial B), which had been immunized with an undiluted and with two-fold serially diluted bacterin (from 1:200 to 1:25,600). In the challenge test in hamsters, the bacterin has passed till the dilution of 1:6,400. The control of the challenge inoculum presented a titer of 100 LD50. Adult sows, never been vaccinated against leptospirosis, and that showed negative MAT results using 24 reference serovars and with negative IVLGIT with the LPF strain (Trial 1) had administered two doses of bacterin with 30 day interval and a booster dose at 210th day after the first application of the undiluted bacterin and the two-fold diluted ones (1:400 to :3,200). The animals were 18 monitored with bleeding performed each 30 days. The levels of antibodies evaluated by MAT and IVLGIT showed the maximum peak at the 30th day after the second vaccination of the bacterin, with high magnitude found with the undiluted bacterin, however, at the 120th day after the second vaccination there were found a marked decline in antibodies levels. To find a better immunization scheme (Trial 2), the sows received two doses of undiluted bacterin with 30 day interval and the booster dose at the 150th day after the first dose. The reduction on the interval of revaccination after the two initial doses determined the persistence of a higher levels agglutinins and neutralizing antibodies with titers 0.4 log. In suckling piglets born from sows immunized with the bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL, the passive transference of antibodies was confirmed by MAT titers detected on the fifth day, and by IVLGIT titers, at the fifth and tenth days after birth. In the study of weaned piglets immunized with the bacterin at the concentrations of 106, 107, 108 and 109 leptospires/mL (Trial 3), the highest antibodies levels were observed at the 30th day after the second immunization, with greater magnitude for the bacterin tested at the concentration of 109 leptospires/mL. The final results indicate that sows and weaned piglets, primo-vaccinated and revaccinated with 30 day interval with bacterin that had passed in the potency-challenge test in hamsters, presented the IVLGIT results varying (95% CI) from 0.87 log to 1.35 log for sows and 1.22 to 1.58 log for weaned piglets, at the 60th day after the first vaccination. In adult sows the highest anti-IgG ELISA titer reached 12,800, obtained after the booster vaccine dose performed at 210th day from the first vaccination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11102012-113434 |
| Date | 21 March 2012 |
| Creators | Amane Paldês Gonçales |
| Contributors | Silvio Arruda Vasconcellos, Patricia Antonia Estima Abreu de Aniz, Margareth Elide Genovez, Andrea Micke Moreno, Francisco Rafael Martins Soto |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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