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Previous issue date: 2012-10-31 / The presence of Bacillus spp. in milk is an important problem for the dairy industry due to their capability of sporulation and the possibility of spore resistance to heat treatment by ultra high temperature (UHT). Bacillus sporothermodurans survive to the UHT system, germinating and growing in stored milk and, if not correctly identified and quantified, can exceed the criterion established for mesophilic aerobic, besides altering the quality of dairy products when in high concentrations. On the other hand, contamination of milk by Bacillus cereus is not only an important cause of deterioration, but is also associated with the occurrence of diarrhea and emetic syndromes. Traditionally, these microorganisms are identified and quantified in food using conventional microbiological techniques, but the Polymerase Chain Reaction (PCR) based methods have been widely used for the same purpose. However, PCR cannot distinguish between viable and dead cells, which can be overcame with the use of DNA intercalating, such as propidium monoazide (PMA). PMA binds to DNA derived from cells with damaged membranes, preventing their amplification by PCR, allowing, thus, the selective detection of viable cells. Therefore, this thesis aimed to characterize the thermal resistance of B. sporothermodurans and to develop methods of detection and quantificatification of viable cells of B. sporothermodurans and B. cereus in milk samples by qPCR associated with PMA. Isothermal and non-isothermal treatments allowed the determination of the profile of heat resistance of B. sporothermodurans spores to heat UHT process, predicting that to 121?C was found a D value between 2 a 4 min. The selective detection and quantification of B. sporothermodurans and B. cereus by PMA-qPCR were developed targeting 16S rRNA gene and hemolysin gene, respectively.The treatment with PMA from pure culture and artificially contaminated UHT milk were standardized by end-point PCR for the detection of viable cells of these microorganisms. The inhibition of amplification of DNA from dead cells was obtained at a concentration of 30μg/mL PMA. The standardization of qPCR assays were performed using hydrolysis probes (TaqMan? system) specific to each target gene. The quantification limit from UHT milk artificially contaminated was 2.5 x 102 CFU/mL for B. sporothermodurans and 7.5 x 102 CFU/mL for B. cereus. The assays were applied to 135 samples of UHT milk of different commercial brands, comparing with the conventional method of cultivation for each microorganism. B. sporothermodurans and B. cereus were respectively detected in 14 (10.4%) and 44 (32.6%) of the samples by molecular methods developed, and in 11 (8.1%) and 15 (11.1%) by conventional culturing methods. The PMA-qPCR methods developed in this study were specific and sensitive for the detection and quantification of viable B. sporothermodurans and B. cereus cells, being applicable for the evaluation of milk samples, reducing the time for the analysis of this product. Furthermore, the results showed that B. cereus can be found in UHT milk / A presen?a de Bacillus spp. em leite representa um importante problema para a ind?stria de latic?nios devido ? sua capacidade de esporula??o e ? possibilidade de resist?ncia do esporo ao tratamento t?rmico por ultra alta temperatura (UAT). O Bacillus sporothermodurans sobrevive ao sistema UHT, germinando e se multiplicando no leite estocado e, caso n?o seja corretamente quantificado e identificado, pode ultrapassar o limite estabelecido pela legisla??o para microrganismos mes?filos aer?bios, al?m de alterar a qualidade dos produtos l?cteos quando em altas concentra??es. Por outro lado, a contamina??o de leite por Bacillus cereus constitui n?o somente uma importante causa de deteriora??o, mas tamb?m est? associada com a ocorr?ncia das s?ndromes em?tica e diarreica. Tradicionalmente, estes microrganismos s?o identificados e quantificados em alimentos atrav?s de t?cnicas cl?ssicas de cultivo, mas m?todos baseados na Rea??o em Cadeia pela Polimerase (PCR) tamb?m t?m sido amplamente utilizados. Entretanto, a PCR n?o distingue c?lulas mortas de c?lulas vi?veis, o que pode ser contornado com o emprego de intercalantes de DNA, como o prop?dio monoazida (PMA). O PMA se liga ao DNA derivado de c?lulas com membranas rompidas, impedindo suas amplifica??es na PCR, permitindo, assim, a detec??o seletiva de c?lulas vi?veis. Portanto, a presente tese teve por objetivo caracterizar a resist?ncia t?rmica de B. sporothermodurans, bem como desenvolver m?todos de detec??o e quantifica??o de c?lulas vi?veis de B. sporothermodurans e de B. cereus em amostras de leite atrav?s de PCR associada ao PMA. Tratamentos isot?rmicos e n?o isot?rmicos permitiram a determina??o do perfil de resist?ncia t?rmica de esporos de B. sporothermodurans ao processo UHT, predizendo que a 121?C foi encontrado um valor D entre 2 a 4 min.A detec??o e quantifica??o seletivas de B. sporothermodurans e de B. cereus atrav?s de PMA-qPCR foram desenvolvidas utilizando o gene RNAr 16S e o gene da hemolisina como alvos, respectivamente. O tratamento com PMA a partir de cultura pura e leite UHT artificialmente contaminado foi padronizado atrav?s da PCR convencional para a detec??o de c?lulas vi?veis destes microrganismos. A inibi??o da amplifica??o de DNA de c?lulas mortas foi obtida na concentra??o de 30μg/mL de PMA. A padroniza??o dos ensaios de qPCR foram realizados utilizando sondas de hidr?lise (sistema TaqMan?) espec?ficas para cada gene alvo. O limite de quantifica??o a partir de leite UHT artificialmente contaminado foi de 2,2 x 102 UFC/mL para B. sporothermodurans e de 7,5 x 102 UFC/mL para B. cereus. As t?cnicas foram aplicadas a 135 amostras de leite UHT de diferentes marcas comerciais, comparando com a metodologia cl?ssica de cultivo para cada microrganismo. B. sporothermodurans e B. cereus foram, respectivamente, detectados em 14 (10,4%) e 44 (32,6%) das amostras analisadas pelos m?todos moleculares desenvolvidos, e em 11 (8,1%) e 15 (11,1%) pelos m?todos convencionais de cultivo. Os m?todos de PMA-qPCR desenvolvidos neste estudo foram espec?ficos e sens?veis para a detec??o e quantifica??o de c?lulas vi?veis de B. sporothermodurans e de B. cereus, mostrando-se aplic?veis para serem utilizados na avalia??o de amostras de leite, reduzindo o tempo de an?lise deste produto. Al?m disso, os resultados demonstraram que B. cereus pode ser encontrado em leite tratado pelo sistema de UHT
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/5453 |
| Date | 31 October 2012 |
| Creators | Cattani, Fernanda |
| Contributors | Oliveira, Silvia Dias de |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, BR, Faculdade de Bioci?ncias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8198246930096637360, 600, 600, 36528317262667714 |
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