Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06072007-110106 |
| Date | 30 June 2005 |
| Creators | Michelin, Michele |
| Contributors | Polizeli, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0021 seconds