Les biofilms représentent une contrainte technologique dans le secteur industriel et sont à l'origine de nombreux cas d'infections chroniques dans le domaine médical. De ce fait, la compréhension des processus biologiques qui s'opèrent au sein de ces communautés microbiennes est un défi permanent. Des méthodes spécifiques, sensibles et diversifiées s'avèrent essentielles pour apporter une connaissance approfondie de l'organisation des biofilms en réponse à des facteurs environnementaux. La matrice extracellulaire qui englobe les microorganismes constitue un réseau complexe, et la description de sa composition et de sa structure constitue un enjeu majeur. Des outils de caractérisation in situ et non-destructifs des Substances ExoPolymériques (SEP) ont pu être proposés lors de ce travail de thèse : des méthodes de quantification ciblant spécifiquement chaque composant majeur de la matrice extracellulaire ont ainsi été développées et validées sur des biofilms modèles. Ces biofilms, choisis pour leur diversité en terme de matrice extracellulaire sont formés par les souches Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Bacillus licheniformis CIP 110824 et Weissella confusa LBAE-UPS C39-2. Des critères communs ont été retenus pour guider le choix des marqueurs retenus pour développer les dosages : spécificité pour la détection de toutes les formes moléculaires d'une même famille biochimique, sensibilité pour la détection de faibles quantités de polymères dans des biofilms en microplaque, et possibilité d'observation en microscopie basée sur la détection de fluorescence. Une stratégie commune a été adoptée pour la quantification des exoprotéines (ePN), exopolysaccharides (ePS) et fibres amyloïdes (FA) de la matrice et a consisté à : (i) définir une molécule standard pour calibrer le test ; (ii) analyser d'éventuelles interférences en solution ; (iii) valider la faisabilité et la fiabilité du test in situ par la méthode des ajouts dosées réalisée sur chacun des biofilms modèles. Un composé naturel pro-fluorescent, l'épicocconone, a été retenu pour la quantification des exoprotéines. Le test a montré une limite de détection de 0,2 µg par puits, sans aucune interférence significative des autres composants majeurs du biofilms (ePS, ADNe, cellules). D'autre part, les protéines sous forme amyloïdes ont pu être détectées avec la même sensibilité que les non amyloïdes par ce marqueur. Par la suite, les exopolysaccharides ont été dosés en exploitant la réaction de Schiff, et la méthode a permis d'obtenir une limite de détection de 0,3 µg par puits. Les protéines amyloïdes bactériennes (FA) ont également été quantifiées au moyen du marqueur Thioflavine T. La k-caséine a été utilisée comme étalon, après fibrillation de la protéine native in vitro. / Biofilms are detrimental in many industrial and medical areas and understanding of biofilms processes has been a challenge for decades. Specific, sensitive and rapid methods for monitoring biofilm formation are essential for a deep knowledge of biofilm organization and response to environmental factors. In such complex network that constitutes the biofilm matrix, it has become a major issue to succeed in describing its composition and local structure to determine the interactions that govern the biofilm formation. Non-destructive and in situ methods for Exopolymeric Substances (EPS) characterization were proposed along this PhD work. The first aim of the study was to propose some quantitative tools that would specifically target each major compound of the biofilm matrix. Some performance criteria were commonly established to guide the choice of each dye and to validate each step of the analytical development. These requirements can be displayed in terms of biochemical specificity, sensitivity and applicability on fluorescence-based microscopy. A common experimental strategy was carried out to quantify the exoproteins (ePN), exopolysaccharides (ePS) and amyloid fibrils (AF) and aimed at (i) choosing a calibration standard; (ii) analyzing in vitro interferences; (iii) validating the practicability and the reliability of each proposed method for an in situ implementation on biofilms. This last criteria was verified by implementing the Standard Addition Method (SAM). For that purpose, a first method was developed to take advantage of a natural pro-fluorescent dye, called epicocconone, to quantify the ePN of three model bacterial biofilms formed by the strains Bacillus licheniformis CIP 110824, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 and Weissella confusa LBAE-UPS C39.2. The three bacterial models were chosen because of their contrasted EPS matrix composition. This method showed a detection limit of about 0.2µg per well and no significant interference were revealed. Moreover the epicocconone assay was able to quantify the AF with the same sensitivity as the other proteins. Subsequently, exopolysaccharides from the same strains were assayed by applying the Periodic acid-Schiff reaction in a microplate format. This chemical reaction targets the majority of the hydroxyl groups of carbohydrate and allows to give an exhaustive estimation of the sugar content of the matrix with a detection limit of 0.3µg per well. Bacterial amyloids were also specifically quantified by the using of the benzothiazole dye Thioflavine T (ThT). An amyloidogenic protein, the ?-casein, was used as standard after an in vitro fibrillation of the native form.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016TOU30010 |
| Date | 04 February 2016 |
| Creators | Randrianjatovo-Gbalou, Irina |
| Contributors | Toulouse 3, Girbal, Elisabeth |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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