La maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 35 millions de personnes à travers le monde ce qui en fait la première forme de démence. Le principal facteur de risque de cette maladie est l’âge et donc, avec l’augmentation de l’espérance de vie, on pense que ce nombre va doubler d’ici 2025. C’est donc un problème de santé publique. Le mécanisme à l’origine de la MA n’est pas connu, et il n’existe aucun traitement permettant de guérir ou de ralentir efficacement l’évolution des symptômes. Il est donc urgent de mieux comprendre cette maladie afin de proposer aux patients des traitements efficaces. Certaines études épidémiologiques ont montré que l’hypercholestérolémie est un facteur de risque pour la MA. A l’inverse, la prise de statines diminuerait les risques de développer cette maladie. De plus, des études réalisées in vitro et in vivo ont montré que le cholestérol peut favoriser la production des peptides amyloïdes qui sont à l’origine de la formation des plaques, caractéristiques de la MA. Enfin, certaines études ont montré qu’une baisse des niveaux de HDL peut être un facteur de risque pour la MA. Tous ces résultats nous amènent à penser que le métabolisme du cholestérol puisse être altéré dans la MA. La PON1 est une enzyme associée aux HDL. Elle possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-oxydantes. Certaines études ont montré que son activité est réduite dans la MA, et que certains de ses polymorphismes sont associés à cette maladie. La PON1 pourrait donc jouer un rôle dans la MA. Mon projet de thèse a pour but d’investiguer si l’efflux du cholestérol est altéré dans la MA, et de comprendre le mécanisme à l’origine de cette éventuelle altération. Il vise également à étudier la PON1 dans la MA. Nos résultats montrent que l’efflux du cholestérol est diminué dans la MA. Cette baisse est due à une perturbation de la fonctionnalité des HDL et non, à une baisse de l’expression du transporteur ABCA1 qui est impliqué dans la première étape de l’efflux du cholestérol. Nos résultats suggèrent que la baisse de fonctionnalité des HDL soit due à leur oxydation, et à une altération de leur structure. Notre étude montre que l’activité paraoxonase est réduite de manière non significative dans la MA supposant donc, une légère baisse de la fonctionnalité de la PON1. De plus, les polymorphismes 192Q/R et 55L/M de la PON1 ne sont pas associés à cette maladie. Enfin, nos résultats montrent que les HDL des personnes Alzheimer sont plus sensibles à l’oxydation probablement du fait d’une baisse de la fonctionnalité de la PON1. En conclusion, dans la MA, les HDL sont oxydés et leur structure est altérée ce qui entraîne une baisse de l’efflux du cholestérol. Une altération de la fonctionnalité de la PON1 pourrait expliquer, en partie, la sensibilité des HDL à l’oxydation.

Les biofilms représentent une contrainte technologique dans le secteur industriel et sont à l'origine de nombreux cas d'infections chroniques dans le domaine médical. De ce fait, la compréhension des processus biologiques qui s'opèrent au sein de ces communautés microbiennes est un défi permanent. Des méthodes spécifiques, sensibles et diversifiées s'avèrent essentielles pour apporter une connaissance approfondie de l'organisation des biofilms en réponse à des facteurs environnementaux. La matrice extracellulaire qui englobe les microorganismes constitue un réseau complexe, et la description de sa composition et de sa structure constitue un enjeu majeur. Des outils de caractérisation in situ et non-destructifs des Substances ExoPolymériques (SEP) ont pu être proposés lors de ce travail de thèse : des méthodes de quantification ciblant spécifiquement chaque composant majeur de la matrice extracellulaire ont ainsi été développées et validées sur des biofilms modèles. Ces biofilms, choisis pour leur diversité en terme de matrice extracellulaire sont formés par les souches Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Bacillus licheniformis CIP 110824 et Weissella confusa LBAE-UPS C39-2. Des critères communs ont été retenus pour guider le choix des marqueurs retenus pour développer les dosages : spécificité pour la détection de toutes les formes moléculaires d'une même famille biochimique, sensibilité pour la détection de faibles quantités de polymères dans des biofilms en microplaque, et possibilité d'observation en microscopie basée sur la détection de fluorescence. Une stratégie commune a été adoptée pour la quantification des exoprotéines (ePN), exopolysaccharides (ePS) et fibres amyloïdes (FA) de la matrice et a consisté à : (i) définir une molécule standard pour calibrer le test ; (ii) analyser d'éventuelles interférences en solution ; (iii) valider la faisabilité et la fiabilité du test in situ par la méthode des ajouts dosées réalisée sur chacun des biofilms modèles. Un composé naturel pro-fluorescent, l'épicocconone, a été retenu pour la quantification des exoprotéines. Le test a montré une limite de détection de 0,2 µg par puits, sans aucune interférence significative des autres composants majeurs du biofilms (ePS, ADNe, cellules). D'autre part, les protéines sous forme amyloïdes ont pu être détectées avec la même sensibilité que les non amyloïdes par ce marqueur. Par la suite, les exopolysaccharides ont été dosés en exploitant la réaction de Schiff, et la méthode a permis d'obtenir une limite de détection de 0,3 µg par puits. Les protéines amyloïdes bactériennes (FA) ont également été quantifiées au moyen du marqueur Thioflavine T. La k-caséine a été utilisée comme étalon, après fibrillation de la protéine native in vitro. / Biofilms are detrimental in many industrial and medical areas and understanding of biofilms processes has been a challenge for decades. Specific, sensitive and rapid methods for monitoring biofilm formation are essential for a deep knowledge of biofilm organization and response to environmental factors. In such complex network that constitutes the biofilm matrix, it has become a major issue to succeed in describing its composition and local structure to determine the interactions that govern the biofilm formation. Non-destructive and in situ methods for Exopolymeric Substances (EPS) characterization were proposed along this PhD work. The first aim of the study was to propose some quantitative tools that would specifically target each major compound of the biofilm matrix. Some performance criteria were commonly established to guide the choice of each dye and to validate each step of the analytical development. These requirements can be displayed in terms of biochemical specificity, sensitivity and applicability on fluorescence-based microscopy. A common experimental strategy was carried out to quantify the exoproteins (ePN), exopolysaccharides (ePS) and amyloid fibrils (AF) and aimed at (i) choosing a calibration standard; (ii) analyzing in vitro interferences; (iii) validating the practicability and the reliability of each proposed method for an in situ implementation on biofilms. This last criteria was verified by implementing the Standard Addition Method (SAM). For that purpose, a first method was developed to take advantage of a natural pro-fluorescent dye, called epicocconone, to quantify the ePN of three model bacterial biofilms formed by the strains Bacillus licheniformis CIP 110824, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 and Weissella confusa LBAE-UPS C39.2. The three bacterial models were chosen because of their contrasted EPS matrix composition. This method showed a detection limit of about 0.2µg per well and no significant interference were revealed. Moreover the epicocconone assay was able to quantify the AF with the same sensitivity as the other proteins. Subsequently, exopolysaccharides from the same strains were assayed by applying the Periodic acid-Schiff reaction in a microplate format. This chemical reaction targets the majority of the hydroxyl groups of carbohydrate and allows to give an exhaustive estimation of the sugar content of the matrix with a detection limit of 0.3µg per well. Bacterial amyloids were also specifically quantified by the using of the benzothiazole dye Thioflavine T (ThT). An amyloidogenic protein, the ?-casein, was used as standard after an in vitro fibrillation of the native form.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie dégénérative liée à une résistance des tissus à l’insuline et à la mort des cellules β-pancréatiques. Il touche près de 400 millions de personnes dans le monde. Les traitements actuels sont symptomatiques et présentent soit des effets secondaires importants soit peu d’effet sur la réduction de la mortalité ou des complications cardiovasculaires. L’agrégation du peptide amyloïde hIAPP (human Islet Amyloid PolyPeptide) est impliquée dans la destruction des cellules β-pancréatiques. A l’état pathologique, hIAPP adopte une conformation en feuillets β, conduisant à son agrégation en formant des oligomères toxiques responsables de la mort des cellules β-pancréatiques. Bloquer cette agrégation est une voie à explorer pour un traitement étiologique du DT2. Des peptides et des peptidomimétiques de type azapeptide, basés sur les séquences peptidiques clés impliquées dans la structuration de hIAPP agrégé, ont été conçus rationnellement dans le but d’interagir avec le peptide de manière sélective et d’inhiber son agrégation. Le développement de différentes voies de synthèse des azapeptides contenant 2 acides aza-aminés consécutifs a été réalisé. L’activité anti-fibrillation des composés a été évaluée par fluorescence à la Thioflavine-T et par microscopie électronique en transmission. Pour les composés les plus prometteurs, l’activité anti-oligomérisation a été évaluée par électrophorèse capillaire et par spectrométrie de masse à mobilité ionique. Ce travail a ainsi permis de développer des composés peptidomimétiques originaux, présentant une activité inhibitrice prometteuse de l’agrégation du peptide amyloïdogénique hIAPP, impliqué dans le diabète de type 2. / Type II diabetes (T2D) is a degenerative disease linked to insulin resistance and pancreatic β-cells death. Worldwide, approximately 400 million people currently have T2D. Actual treatments are symptomatic and have either significant side effects or little effect on reducing mortality or cardiovascular complications. The aggregation of hIAPP peptide (human Islet Amyloid PolyPeptide) is involved in pancreatic β-cells destruction. At the pathologic state, hIAPP adopt a β-sheet rich conformation, leading to its aggregation forming toxic oligomers responsible of pancreatic β-cells death. Blocking this aggregation is a way to explore for etiological treatment of T2D. Peptides and peptidomimetics of azapeptide type, based on key sequences linked to the structuration of aggregated hIAPP, have been rationally designed, to interact with the peptide in a selective manner, and to inhibit its aggregation. The development of different synthetic routes to prepare azapeptides containing 2 consecutive aza-amino acids, have been performed. The anti-fibrillization activity of the compounds have been evaluated by Thioflavin-T fluorescence and by transmission electronic microscopy. For the most promising compounds, the anti-oligomerization activity has been evaluated by capillary electrophoresis and by Ion mobility spectrometry-mass spectrometry. Thus, this work allowed to develop original peptidomimetic compounds displaying a promising inhibitory activity of hIAPP peptide aggregation, involved in type II diabetes.

Un certain nombre de maladies neurodégénératives, comme la maladie de Creutzfeld-Jacob chez l'homme ou la maladie dite de "la vache folle" chez les bovins, sont dues au mauvais repliement d'une protéine cellulaire dite prion. Plusieurs protéines prions ont été identifiées chez des microorganismes comme Ure2p chez Saccharomyces cerevisiae ou HET-s chez Podospora anserina. Ces protéines sont non pathogènes pour l'homme et se comportent comme le prion de mammifères c'est à dire en s'assemblant également en fibres amyloïdes. Chez S. cerevisiae, la protéine Ure2p est associée au phénotype prion [URE3] et est agrégée dans ce type de cellule. Dans un premier temps, nous avons montré que les agrégats [URE3] obtenu in vivo étaient d'une nature différente des fibres amyloïdes produites in vitro. Dans un second temps, la technicité acquise au cours de l'étude biochimique d'Ure2p m'a permis d'aborder celle d'un orthologue, Ure2p de Saccharomyces paradoxus (Ure2p-Sp), qui n'est pas un prion "in vivo". Après avoir montré que les deux protéines sous forme soluble présentent les mêmes caractéristiques biochimiques, je montre qu'elles possèdent la même propension à former des fibres amyloïdes. Dans le cadre de cette étude nous montrons également que ces fibres sont infectieuses laissant penser qu'in vivo cette incapacité de la protéine Ure2p-Sp à basculer sous forme prion est plutôt due à une défaillance du mécanisme de propagation des prions plutôt qu'à une différence de la structure amyloïde proprement dite. Enfin, nous avons pu montrer qu'il était possible de transformer une protéine amyloïde non toxique en une protéine toxique en ne changeant que quelques acides aminés. En poursuivant cette étude par une étude in vitro, j'ai également pu observer que la protéine toxique s'organisait in vitro en de courtes fibres amyloïdes qui pouvaient mimer les intermédiaires responsables de la toxicité au cours des maladies neurodégénératives. Si dans cette première partie l'apport de la biochimie dans l'étude ciblée de différentes protéines amyloïdes de champignons ascomycètes est évident, l'étude des protéines peut également se faire par une approche biochimique globale sans a priori comme dans l'étude de la réponse protéique d'une plante à un stress environnemental. Grâce au séquençage des génomes, la biochimie post-génomique connait un essor exceptionnel et permet de mettre en évidence de nouvelles protéines dans le cadre d'études fonctionnelles. Dans ce but, j'ai mis en oeuvre une technique de protéomique différentielle : l'électrophorèse bidimensionnelle de type DiGE (Differential in-Gel Electrophoresis) dans le cadre de l'étude du protéome d'une plante invasive, le solidage Solidago canadensis, soumise à un stress d'origine anthropique. Cette étude protéomique vient en complément d'une étude phytosociologique des plantes capables de coloniser un sol très dégradé mais aussi de données de biodiversité, croissance et de mesures de la réponse anti-oxydante de ces végétaux. Cette analyse a révélé que sur des sols pollués, le solidage parvient non seulement à produire l'énergie nécessaire à sa croissance mais il parvient également à synthétiser les intermédiaires de biosynthèse du glutathion et des phytochélatines. Ainsi, le solidage est capable de s'adapter à ce milieu ce qui lui permet d'être tolérant à la pollution. Mes premiers résultats de biochimie post-génomique offrent de nouvelles bases pour la compréhension des mécanismes de tolérance au milieu de certaines plantes permettant le développement de technologies innovantes de phytorémédiation afin de restaurer les sols pollués / A number of neurodegenerative illnesses such as Creutzfeld-Jacob disease in humans or the disease known as mad cow disease in bovine, are due to misfolding of a cellular protein called prion. These proteins are not pathogenic for human and can form amyloid fibers like mammalian prion. They are therefore a useful tool to study molecular events responsible for the emergence and propagation of prions. In S. cerevisiae, the Ure2p protein is associated with [URE3] prion phenotype and is aggregated in this cell. Initially, I developed the conditions to characterize Ure2p amyloid fibers by proteolysis and we showed that [URE3] aggregates obtained in vivo were different than amyloid fibers produced in vitro. In a second phase, the technicity acquired during the biochemical study of Ure2p allowed me to approach the study of an ortholog, Saccharomyces paradoxus Ure2p (Ure2p-Sp), which is not an "in vivo" prion. After showing that soluble forms of the two proteins have the same biochemical characteristics, I show that they have the same propensity to form amyloid fibers. In this study we show that these fibers are infectious in vivo, suggesting that the incapacity of Ure2p-Sp protein to switch into a prion form is rather due to a failure in prion propagation mechanism rather than differences in amyloid structure itself.Then using all technologies that I introduced in the laboratory, I studied the relationship between amyloid structure and toxicity in S. cerevisiae. We showed that it was possible to transform a non-toxic amyloid protein in a toxic form by changing only a few numbers of amino acids. An in vitro study has also shown that the toxic protein was organized into short amyloid fibers that could mimic the intermediates responsible for toxicity in neurodegenerative diseases.The last chapter of this manuscript focuses on research that I developed in the Laboratory of Ecotoxicology Interactions,Biodiversity, Ecosystems, Metz. Within this laboratory, we aim at identifying effects of disturbances and physico-chemical analysis of the mechanisms involved at different scales of observation, from organisms to ecosystems.Progress in genomes sequencing allows an exceptional development in post-genomic biochemistry and can highlight new proteins through functional studies. In order to better understand molecular events responsible for these responses, I introduce a differential technique of proteomics: a DiGE two-dimensional electrophoresis (Differential In-Gel Electrophoresis). I developed this technics in a proteome study of an invasive plant, the goldenrod Solidago canadensis, under metal stress. This proteomic study supplements a phyto-sociological study of plants competent in colonizing a very poor soil but also of biodiversity data, growth and measures of the antioxidant response of these plants. This analysis revealed that in polluted soils, the goldenrod achieves not only to produce energy for its growth but it also achieves to biosynthesize intermediates of glutathion and phytochelatins. Thus, the goldenrod is able to adapt to its environment, which allows it to be tolerant to pollution. My first results of post-genomic biochemistry provide new bases for understanding the molecular mechanisms behind environmental tolerances. These studies may help us to identify the most adapted plants to these environments and why they are. They may help us to understand the effects of these pollutants and allow the development of innovative technologies for phytoremediation to restore polluted soils

La contamination des ressources en eau potable et des terres agricoles par les pesticides qui entrent dans la chaine alimentaire est un problème environnemental et sanitaire majeur. Des études épidémiologiques ont montré un lien entre l’exposition aux pesticides et la maladie de Parkinson, mais peu d’études sont disponibles sur les autres pathologies neurodégénératives. Notre hypothèse est que les pesticides pourraient être des facteurs déclencheurs ou aggravants, communs aux maladies neurodégénératives.Au laboratoire, nous avons identifié par criblage sur la protéine prion, PrP, un composé nommé A6 décrit pour ses propriétés herbicides. A6 est un dérivé de l’α-terthiényl, molécule naturelle extraite des œillets d’inde. Le composé A6 a la capacité de promouvoir des formes oligomériques de la protéine prion sur une lignée cellulaire infectée par des prions. Mon projet de recherche visait à étudier les effets du bio-herbicide A6 sur l’agrégation et la propagation des prions in vivo. Des souris infectées par les prions ont été traitées avec différentes doses de cette molécule (5, 10 et 20 mg/kg). A la dose de 5 mg/kg, le composé A6 diminue le temps de survie des animaux avec une augmentation de la charge amyloïde. Tandis qu’aux plus fortes doses le traitement par A6 augmente la survie des souris avec une diminution de la charge amyloïde. Par un test de centrifugation rapide (RCA), nous avons montré que les faibles concentrations d’A6 favorisent la formation d’oligomères solubles de PrPSc SDS résistants (rSDS-PrPSc), alors que les plus fortes concentrations induisent des formes insolubles. L’analyse des cerveaux montre que seules les souris traitées avec 10 et 20 mg/kg d’A6 présentent des formes dimériques de rSDS-PrPSc. Cette étude montre une dualité d’effet du composé A6 : à de faibles doses, il favorise la pathologie probablement via des formes oligomériques solubles favorisant la réplication des prions. A de plus fortes doses, le composé A6 piègerait une partie de l’infectiosité des prions sous forme d’agrégats amorphes SDS résistants, bloquant la réplication des prions, et ayant un effet « protecteur ».Une recherche d’analogues structurels au composé A6 a permis l’identification d’une classe d’antifongiques commercialisés : les anilinopyrimidines. Cette famille est composée de 3 molécules : cyprodinil, mépanipyrim et pyriméthanil, qui luttent contre des champignons responsables de la pourriture grise des fruits. L’analyse de nombreux rapports a révélé que nous sommes chroniquement exposés à des résidus d’anilinopyrimidines. Dans cette deuxième étude, nous avons étudié l’effet de ces 3 fongicides dans plusieurs modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) et les conséquences sur les marqueurs de la pathologie. Des études d’incubation ex vivo associées à des expériences de cinétique d’agrégation de peptides Aβ1-42 ont montré que ces composés interagissent directement avec les peptides et accélèrent sa cinétique d’agrégation. Afin de déterminer leurs effets in vivo, nous avons exposé chroniquement des souris J20 à un cocktail des 3 fongicides via l’eau de boisson. Les souris ont été traitées à 0,1 μg/L (0,44 nM) de chaque composé, correspondant à la concentration maximale autorisée dans l’eau potable. Après 9 mois de traitement, l’analyse des souris J20 a montré une augmentation du nombre et de la surface des plaques amyloïdes au niveau de l’hippocampe et du cortex. Pour déterminer à quel moment se produit l’effet proagrégant du cocktail, une étude longitudinale d’apparition des agrégats à 3, 6 et 9 mois par microscopie biphotonique, a montré que les plaques amyloïdes augmentent entre 6 et 9 mois et que les pesticides exacerbent les agrégats vasculaires. Les anilinopyrimidines modifient la production et la clairance des peptides Aβ en augmentant l’expression de BACE1 et en diminuant l’expression de la néprilysine. Nos travaux montrent que les antifongiques aggravent la MA. / Contamination of the drinking water and agricultural lands by the use of pesticides entering into the food chain is a major environmental and health problem. Epidemiological studies have shown a link between pesticide exposure and Parkinson's disease, but few studies are available on other neurodegenerative disorders. Our hypothesis is that pesticides may be triggering or aggravating factors common to neurodegenerative diseases.In the laboratory, we identified by a screening on the prion protein, PrP, a compound named A6 described for its herbicidal properties. A6 is a derivative of α-terthienyl, a natural molecule extracted from marigolds. A6 compound has the ability to promote oligomeric forms of the prion protein on a prion-infected cell line. My research project aimed to study the effects of the bioherbicide A6 on prion aggregation and propagation in vivo. Mice infected with prions were treated with different doses of this molecule (5, 10 and 20 mg/kg). At the dose of 5 mg/kg, A6 compound decreases the survival time of animals with an increase of the amyloid load. While at the higher doses, A6 treatment increases survival of mice with a decreased amyloid burden. Using a rapid centrifugation assay (RCA), we have shown that low concentrations of A6 promote soluble SDS-resistant oligomers of PrPSc (rSDS-PrPSc), while higher concentrations favour insoluble forms. Brain analysis shows that only mice treated with 10 and 20 mg/kg of A6 exhibit dimeric forms of rSDS-PrPSc. This study shows a dual effect of A6 compound: at low doses, it strenghtens the pathology probably via soluble oligomeric forms favouring the replication of prions. At higher doses, A6 compound would trap part of the infectivity of prions as SDS resistant amorphous aggregates, blocking prion replication, and thus having a “protective” effectA search for structural analogs of A6 compound allowed the identification of a class of commercial antifungals: anilinopyrimidines. This family is composed of 3 molecules: cyprodinil, mepanipyrim and pyrimethanil, used to fight against fungi responsible for the gray mold of fruits. Analysis of many reports have revealed that we are chronically exposed to residues of anilinopyrimidines. In this second study, we evaluated the impact of the 3 fungicides in several models of Alzheimer’s disease (AD) and their consequences on pathological markers. Ex vivo incubation studies associated to kinetics of fibril formation of Aβ1-42 peptides have shown that these compounds interact directly with Aβ peptides and accelerate its kinetics of aggregation. To determine their effects in vivo, we chronically exposed J20 mice to a cocktail of the 3 fungicides through drinking water. Mice were treated with 0.1 μg/L (0.44 nM) of each compound, corresponding to the maximal concentration allowed in the tap water. After 9 months of treatment, analysis of J20 mice showed an increase in the number and surface of plaques in the hippocampus and cortex. To determine the moment when the pro-aggregative effect occurs, a longitudinal study of appearance of aggregates at 3, 6 and 9 months by 2-photon microscopy was done. Our results showed that amyloid plaques increase between 6 and 9 months, and exacerbate vascular amyloid aggregates. Anilinopyrimidines modified the production and clearance of Aβ peptides by increasing BACE1 expression and by decreasing neprilysin expression. Our researches show a role of fungicides in the aggravation of AD.

La fibrillation anormale de la protéine tau est un phénomène présent dans de nombreuses maladies neurodégénératives, dont la maladie d’Alzheimer, et conduit à la formation de fibres amyloïdes appelées dégénérescences neurofibrillaires. L’utilisation de molécules organiques capables de marquer ces fibres ou d’inhiber leur formation revêt un intérêt à la fois diagnostic et thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. Une série d’aurones a été synthétisée et leur capacité à interagir et interférer avec le processus de fibrillation a été évaluée in vitro sur des modèles de fibres de tau développés ou optimisés lors de ce projet. Ce travail a permis de montrer que des aurones polyhydroxylées sont capables d’agir comme sonde et/ou comme inhibiteur du processus de fibrillation. Afin d’élargir les applications possibles des aurones, la ligation d’aurones avec des biomolécules ou encore leur radiomarquage a également été évaluée. / The fibrillation of the tau protein occurs in many neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease, and leads to the formation of amyloid fibres called neurofibrillary tangles. Using organic molecules able to mark these fibres or inhibit their formation provides an interest both in diagnosis and therapy in Alzheimer’s disease. A series of aurones was synthesized and their ability to interfere with the fibrillation process was evaluated in vitro on models of tau fibres developed in this project. This work shows that polyhydroxylated aurones are able to act both as probes and as inhibitors of the fibrillation process. The ligation of these aurones with biomolecules or their radiolabelling has also been investigated.

Dans l’épiderme, les mélanocytes participent à la protection de la peau contre les rayons ionisants du soleil en synthétisant un pigment, la mélanine, dans des compartiments apparentés aux lysosomes appelés melanosomes. La mélanogenèse est un processus séquentiel initié par la production de fibres amyloïdes dont la composante principale est la protéine PMEL. Ces fibres séquestrent la mélanine et permettent l’élimination d’intermédiaires toxiques produits lors de sa synthèse. La mélanogenèse et le phénotype pigmenté sont affectés lorsque le processus de formation des fibres est altéré. Les fibres résultent du clivage de PMEL dans les endosomes précurseurs des mélanosomes mais les protéases impliquées dans ce processus restent peu ou pas caractérisées. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation des fibres amyloïdes dérivées de PMEL, j’ai étudié le rôle de deux protéases : les Bêta-sécrétases BACE1 et BACE2. En combinant des techniques de biochimie, d’immunocytochimie et d’imagerie photonique et électronique, j’ai montré que la perte de l’expression de Bace2 in vivo (souris KO BACE2) ou sa déplétion (siRNA) dans une lignée de mélanocytes inhibent le clivage amyloïdogénique de PMEL et affectent à la fois la formation de fibres de PMEL dans les mélanosomes et la pigmentation. J’ai pu notamment reproduire in vitro le clivage spécifique de PMEL en utilisant une forme recombinante de BACE2. En parallèle, j’ai également étudié le rôle de BACE1 dans la mélanogenèse. Mes résultats indiquent que BACE1, bien que n’étant pas impliquée dans le clivage de PMEL, régulerait la maturation des mélanosomes précoces in vivo et in cellulo, en modulant les contacts entre mélanosomes et réticulum endoplasmique (RE). Dans les mélanocytes, BACE1 est présente dans le RE et interagit avec des protéines impliquées dans les contacts RE-endosomes. Ces contacts seraient cruciaux pour le transfert de molécules nécessaires à la maturation des mélanosomes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle pour chacune des Bêta-sécrétases dans le processus de mélanogenèse, levant le voile sur des processus clés liés à la biogenèse des mélanosomes. Par ailleurs, les fibres de PMEL constituant le modèle le plus abouti de l’amyloïdogenèse physiologique chez les mammifères, ces études pourraient à plus long terme aider à la compréhension de la formation des fibres amyloïdes pathologiques ; notamment dans la maladie d’Alzheimer où l’amyloïdogenèse d’APP est très similaire à celle de PMEL. / In the epidermis, melanocytes synthetize a pigment called melanin, in lysosome-related-organelles called melanosomes, in order to protect the skin against the ionizing radiations of the sun. Melanogenesis is a sequential process initiated by the formation of amyloid fibrils whose principal component is the protein PMEL. Those fibrils sequester the melanin pigment and allow the removal of toxic intermediates formed during its synthesis. Melanogenesis and the pigmented phenotype are affected when the process of fibrils formation is altered. Fibrils come from the processing of PMEL in endosome precursors of melanosomes but the proteases implicated in this process are not well characterized. In order to better understand the mechanisms implicated in the formation of the PMEL amyloid fibrils, I studied the role of two proteases: the Beta-secretases BACE1 and BACE2. Using a combination of biochemical, immunocytochemical methods and photonic and electronic imaging, I have shown that the loss of Bace2 expression in vivo (BACE2 KO mice) or its depletion (siRNA), in a melanocyte cell line, inhibit the amyloidogenic processing of PMEL and affect both the formation of the PMEL fibrils in melanosomes and pigmentation. I could reproduce in vitro the specific cleavage of PMEL by using a recombinant form of BACE2. In parallel, I have also studied the role of BACE1 in melanogenesis. My results indicate that BACE1, even though it is not implicated in PMEL processing, could regulate the maturation of early melanosomes in vivo and in cellulo, by modulating the contacts between melanosomes and endoplasmic reticulum (ER). In melanocytes, BACE1 is present in the ER and interacts with proteins implicated in ER-endosomes contacts. Those contacts would be crucial for the transfer of molecules that are necessary for melanosome maturation. All together those results demonstrate the role of both Beta-secretases in melanogenesis, and reveal key processes involved in melanosome biogenesis. Moreover, because PMEL fibrils are the most completed model of physiological amyloidogenesis in mammals, theses studies could help in the future the understanding of the formation of pathological amyloid fibrils; in particular in the Alzheimer’s disease where the amyloidogenesis of APP is very similar to the one of PMEL.

Les maladies amyloïdes sont des affections sévères caractérisées par la présence de dépôts extracellulaires fibreux susceptibles de toucher un ou plusieurs tissus du corps humain. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au peptide β amyloïde (Aβ), impliqué dans la maladie d’Alzheimer, ainsi que l’amyline ou Islet Amyloid PolyPeptide (IAPP), impliqué dans le diabète de type 2. Le mécanisme de formation des fibres a été décrit comme un processus en deux étapes : la nucléation, conduisant à la formation d’oligomères et la phase d’élongation conduisant à la formation des fibres. La première partie de ma thèse est consacrée à l’étude des premières étapes d’oligomérisation d’IAPP. Ce projet, qui a fait appel à différentes techniques biophysiques, a permis de montrer que le mécanisme d’oligomérisation d’IAPP était coopératif et caractérisé par l’absence d’espèces de faible poids moléculaire en solution. Ensuite, je me suis intéressée au rôle de l’histidine 18 d’IAPP et l’effet de la charge globale du peptide sur ses propriétés d’oligomérisation. Pour cela, une étude mutationnelle a été réalisée et l’analyse biophysique des mutants en présence de modèles lipidiques a été effectuée à pH 5,5 et à pH 7,4. Les résultats de cette étude ont montré que la substitution du résidu 18 ralentissait la formation des fibres et que le pH acide était globalement défavorable à l’oligomérisation. Enfin, j’ai étudié les interactions entre les peptides amyloïdes et des inhibiteurs potentiels d’origine synthétique ou naturelle. Différents modes d’action de ces inhibiteurs ont ainsi pu être caractérisés, selon leur interaction avec les monomères ou les oligomères des peptides étudiés. / Amyloid diseases, including Alzheimer's (AD), Parkinson's, Prion diseases and type 2 diabetes mellitus (T2DM), are characterized by the accumulation of insoluble fibrillar aggregates in tissues. These diseases are the result of the aberrant folding of proteins that constitute the main component of the fibrils. My thesis project focused on two amyloid peptides: β-amyloid peptide, a 40/42 residue peptide involved in AD, and Islet Amyloid PolyPeptide (IAPP), a 37 residue peptide linked with T2DM. Although the mechanism of oligomerization is still unclear, it is known to be a stepwise process that includes a nucleation phase, where the peptides are mainly monomeric and slowly form aggregates, followed by an elongation phase, characterized by the formation of large prefibrillar oligomers leading to mature fibrils. A first part of my project focused on the early stages of fibrillation of IAPP, using a set of complementary biophysical techniques. This study showed that the oligomerization pathway of IAPP involved no or short time lived oligomers favoring the formation of large aggregates. In a second step, I investigated the effect of residue 18 and global charge of IAPP by a mutational analysis of residue His18 and biophysical analysis at pH 5.5 and 7.4. The results showed that (1) the substitution of His18 slowed down the kinetics of fibrillation of IAPP by affecting the interactions between monomers, (2) acidic pH was unfavorable for the process. Finally, we examined the interaction of amyloid peptides with potential inhibitors of synthetic (sugar or fluor-based peptides) or natural origin (epigallocatechingallate). Different mechanisms of action could be characterized.

Les hydrophobines sont des protéines fongiques caractérisées par leurs propriétés amphipathiques et un motif de quatre ponts disulfures. Leur forme soluble s’auto-assemble aux interfaces hydrophobe/hydrophile pour former une couche amphipatique. Ces protéines sont utilisées par les champignons pour franchir la barrière air/eau, former des hyphes aériennes ou recouvrir les spores les rendant hydrophobes, ce qui facilite leur dispersion dans l’air. L’hydrophobine RodA du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus forme une couche de fibres amyloïdes avec une morphologie en bâtonnets qui recouvre la surface des spores ce qui les rend inertes vis-à-vis du système immunitaire. Nous aspirons à décrire l’auto-association de RodA en bâtonnets, caractériser la structure des fibres et établir les potentiels liens entre structure et inertie immunologique. La protéine recombinante RodA exprimée chez E. coli peut être correctement repliée in vitro et s’auto-associe sous forme de fibres amyloïdes. Comme première étape, la structure et la dynamique de RodA ont été étudiées par RMN en solution. Par rapport aux autres hydrophobines, RodA présente de nouveaux éléments structuraux ainsi que d’autres conservés. Grâce à une étude de mutagénèse, des régions importantes dans la formation des fibres ont été identifiées, certaines impliquées dans le cœur des fibres et d’autres dans les interactions latérales des bâtonnets. Les relations entre la structure et les propriétés immunologiques ont également été établies. L’étude d’autres hydrophobines d’A. fumigatus, probablement impliquées dans la formation du biofilm ou importantes pour la conidiation et la survie des spores, a été initiée.dC), a été initiée. / Hydrophobins are fungal proteins characterised by their amphipatic properties and a pattern of four disulfide bridges. Their soluble form self-assembles at hydrophobic/hydrophilic interfaces to form an amphipatic layer. These proteins are used by fungi to breach the air/water barrier, to form aerial hyphae, or to cover spores rendering them hydrophobic, thus facilitating spore dispersal. The RodA hydrophobin of the opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus forms an amyloid monolayer with a rodlet morphology that covers the surface of spores rendering them inert relative to the immune system. We aim at describing the self-association of RodA into rodlets, characterising the structure of the amyloid rodlets and shedding light on the possible relationships between structure and immunological inertness. Recombinant RodA expressed in Escherichia coli can be successfully refolded in vitro and it can auto-associate into amyloid rodlets. As a first step, we have studied the structure and dynamics of RodA by solution NMR and shown that the protein displays new as well as conserved structural features relative to other hydrophobins. A mutational analysis has highlighted important residues for rodlet formation that may be involved on the one hand in the spine of the amyloid fibres and on the other hand on the lateral association of the rodlets to form a monolayer. We have also established the relationship between structure and immunological inertness. We have initiated the study of other hydrophobins from A. fumigatus, that are most likely involved in biofilm formation or in conidiation and spore survival.

La Maladie d’Alzheimer (MA) est un des challenges sanitaires les plus importants du XXIème siècle. En effet, elle touche 35,6 millions de personnes en 2010, et en atteindra probablement quatre fois plus en 2050.Cependant, peu d’éléments sont à ce jour connus concernant les mécanismes de toxicité de cette maladie. Il semble néanmoins acquis que l’agrégation du peptide amyloïde Aβ est l’élément déclenchant une cascade d’événements cellulaires aboutissant à trois types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, les plaques amyloïdes et une atrophie corticale, révélatrice d’une importante mort neuronale.Différents modèles transgéniques d’étude de la toxicité du peptide Aβ ont été créés au cours des vingt dernières années. Cependant, aucun modèle de levure n’a encore vu le jour, alors que cet organisme est utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude des protéines amyloïdes.J’ai donc cherché à créer ce modèle de toxicité au cours de ma thèse. L’adressage d’une protéine de fusion Aβ-GFP à la voie de sécrétion permet de rendre son expression toxique chez la levure. J’ai démontré que le trafic intracellulaire était un élément important pour la génération d’espèces toxiques. Les orthologues de PICALM, facteur de prédisposition à la MA, sont impliqués dans la toxicité, montrant une conservation des mécanismes de toxicité avec l’Homme. Les constructions semblent avoir la capacité de traverser les membranes afin d’atteindre des cibles cellulaires comme la mitochondrie.Le modèle ainsi construit nous permettra de mettre en place une étude de la relation entre la structure et la toxicité du peptide Aβ et mieux comprendre les mécanismes cellulaires régissant la MA. / Alzheimer’s Disease (AD) is one of the most important sanitary challenges of the XXIst century. Indeed, 35.6 million people are affected in 2010, and there will be probably four times more in 2050. However, little is known about the mechanisms of toxicity of this disease. Nevertheless, it seems that aggregation of the Aβ peptide is the triggering factor of a cascade of cellular events that leads to three characteristic lesions: neurofibrillary tangles, amyloid plaques and a cortical atrophy, revealing an important neuronal death. Different transgenic models for the study of the Aβ peptide toxicity have been created during the past twenty years. However, no yeast model has yet seen the light of day, whereas this organism is used for several years to study amyloid proteins.Therefore I worked to create this model during my thesis. Addressing an Aβ-GFP fusion to the secretory pathway enable this construction to become toxic in yeast. I proved intracellular pathways are important for generation of toxic species. PICALM orthologs, an AD predisposing factor, are involved in toxicity, showing conservation in the mechanisms of toxicity between yeast and man. The constructions seem to be able to cross membranes and reach cytoplasmic targets as mitochondria.Thus, this model will allow us to set a study of the relationship between structure and toxicity of the Aβ peptide and better understand the cellular mechanisms governing AD