Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que a estimulação aguda dos receptores 2-adrenérgicos (2-AR) atenua a perda de massa muscular induzida pela desnervação motora (DEN) por meio de uma via dependente de AMPc/PKA. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ativação crônica destes receptores ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, a ativação desta via de sinalização também está envolvida no controle da estabilidade dos receptores nicotínicos (AChR) na junção neuromuscular (JNM), sugerindo que a densidade dos AChR possa estar sob controle neuro-humoral. Desta forma, aventou-se a possibilidade de que além dos efeitos protetores na massa muscular, a ativação dos receptores 2-AR pudesse mediar a estabilização dos AChR na placa motora. Para testar essa hipótese, camundongos foram submetidos à DEN através da secção do nervo ciático, um protocolo clássico de indução de atrofia muscular e desestabilização dos AChR, e tratados com salina ou clembuterol (CB), um 2-agonista seletivo, por até 14 dias. Após 3 dias de DEN, observou-se redução da massa muscular e aumento do conteúdo proteico e expressão do RNAm de genes relacionados à ativação do sistema Ubiquitina-Proteassoma (atrogina-1 e MuRF1) e do sistema autofágico/lisossomal (catepsina L e LC3). A DEN também promoveu aumento no turnover dos AChR, no número de vesículas endocíticas e na expressão do RNAm para a subunidade 1 dos AChR. Após 7 dias, a DEN reduziu a expressão dos genes relacionados à atrofia e aumentou a atividade da via do AMPc/PKA independentemente do tratamento com CB. Na tentativa de elucidar os sinais extracelulares que produziam esta resposta adaptativa, foi demonstrado que neurônios catecolaminérgicos trafegam ao longo do nervo ciático e sua ablação pela DEN reduziu o conteúdo de noradrenalina muscular. Baseados nestes resultados, foi postulado a existência de uma hipersenbilidade às catecolaminas em músculos desnervados cronicamente. O tratamento com CB por 3 dias aboliu o aumento da expressão dos atrogenes induzido pela DEN e este efeito foi associado ao maior conteúdo de AMPc e de substratos fosforilados pela PKA. Além disso, o CB diminuiu a hiperexpressão do RNAm para catepsina L e LC3 induzida pela DEN de 7 dias. Embora o CB não tenha alterado a meia-vida dos AChR em músculos inervados e desnervados, houve um total bloqueio do aumento do número de vesículas endocíticas contendo o AChR em músculos desnervados e tratados com CB. Corroborando estes dados, o CB aumentou a incorporação de AChR novos nas JNM e este efeito foi também associado à maior expressão do RNAm para a subunidade 1-AChR em músculos desnervados. Esta ação do CB no turnover dos AChR parece ser direta uma vez que neuroniôs catecolaminérgicos presentes no nervo ciático ativam receptores 2-ARe a produção de AMPc especificamente na JNM. Em estudos in vitro, foi demonstrado que a estimulação colinérgica produzida pelo carbacol (10-4M) diminuiu a velocidade de síntese de proteínas, aumentou a proteólise total e a atividade do sistema proteolítico Ca2+-dependente em músculos soleus de ratos por meio da ativação dos receptores nicotínicos. Este efeito catabólico do carbacol foi completamente bloqueado pela adição de CB (10-4M) ao meio de incubação. Os dados obtidos no presente estudo permitem sugerir que a estimulação crônica dos 2-AR no músculo esquelético induz um efeito anti-catabólico pela supressão dos sistemas proteolíticos proteassomal e lisossomal, provavelmente através da via de sinalização do AMPc/PKA. A inibição destes sistemas pode estar relacionada ao aumento do turnover dos AChR, uma vez que a velocidade de incorporação destes receptores na JNM foi aumentada pelo CB. Além disso, os achados que mostram a associação entre neurônios noradrenérgicos e colinérgicos no nervo ciático, que conjuntamente inervam as JNM, e a co-localização de receptores 2-AR e AChR na sinapse permitem sugerir a existência de uma interação funcional entre o sistema colinérgico e adrenérgico na manutenção da massa muscular e da placa motora. / Previous studies from our laboratory have shown that the acute stimulation of 2-adrenergic receptor (2-AR) attenuates the muscle loss induced by motor denervation (DEN) through a cAMP/PKA dependent pathway. However, the molecular mechanisms involved in the chronic activation of these receptors are poorly understood. Furthermore, the activation of this signaling pathway is also involved in controlling the stability of nicotinic receptors (AChR) at the neuromuscular junction (NMJ), suggesting that the density of AChR may be under neurohumoral control. Thus, we postulated that besides the protective effects on muscle mass the activation of 2-AR receptors could mediate the stabilization of AChR in the motor plate. To test this hypothesis, mice were submitted to DEN through of the sciatic nerve section, a classical protocol of induction muscle atrophy and destabilization of AChR, and were treated with saline or clenbuterol (CB), a selective 2-agonist for 14 days. DEN decreased the muscle mass and increased the protein content and mRNA expression of genes related to the activation of the ubiquitin-proteasome system (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic/lysosomal system (cathepsin L and LC3). DEN also promoted an increase in the turnover of AChR, number of endocytic vesicles and the expression of mRNA for the 1 subunit of AChR. Interestingly, chronic DEN induced down-regulation of atrophy related-genes, and increased the activity of cAMP/PKA pathway independently of CB treatment. In an attempt to elucidate the extracellular signals that produced this adaptive response, it was demonstrated that catecholaminergic neurons travels along the sciatic nerve and its ablation by DEN reduces muscle norepinephrine content. Based on these results, it was postulated the existence of a muscle adrenergic hypersensitivity to circulating catecholamines induced by chronic DEN. CB treatment for 3 days completely abolished the higher expression of atrogenes and this effect was associated with increased Camp content and PKA phosphorylated substrates. Furthermore, CB decreased the DEN-induced hyperexpression of cathepsin L and LC3 mRNA at 7 days. Although CB has not altered the half-life of AChR in innervated and denervated muscles, it produced a total blockage of the increased number of endocytic vesicles containing the AChR in denervated muscles. Consistently, CB increased the incorporation of new AChR and this effect was associated with an increased expression of the 1-subunit AChR mRNA in denervated muscles. This action of CB on AChR turnover appears to be direct, since catecholaminergic neurons are present in the sciatic nerve stimulating 2-AR and cAMP production specifically in the NMJ. Furthermore, in vitro studies demonstrated that cholinergic stimulation produced by carbachol (10-4M) decreased the rate of protein synthesis and increased the proteolytic activity of Ca2+-dependent system in rat soleus muscle through activation of nicotinic receptors. This catabolic effect of carbachol was completely blocked by the addition of CB (10-4M) to the incubation medium. These data suggest that chronic stimulation of 2-AR in skeletal muscle induces an anti-catabolic effect by suppressing proteasomal and lysosomal proteolytic systems, probably through the cAMP/PKA signaling. The inhibition of these systems seems to be related to the increased AChR incorporation into NMJ induced by CB treatment. Moreover, the association between noradrenergic and cholinergic neurons in the sciatic nerve, both of which innervate the motor endplates, and the co-localization of AChR and 2-ARat the synapse suggest the existence of a functional interaction between cholinergic and adrenergic systems in the maintenance of muscle mass and motor endplate.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-08092015-202002 |
| Date | 28 August 2015 |
| Creators | Borges, Danilo Lustrino |
| Contributors | Navegantes, Luiz Carlos Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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