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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste estudo nós realizamos um monitoramento cinético, ex vivo, da resposta imune do
hospedeiro, induzida durante infecção murina por L. (L.) amazonensis. Fêmeas de
camundongos BALB/c foram inoculadas subcutaneamente no coxim plantar esquerdo com
106 promastigotas de fase estacionária e o progresso da infecção foi monitorado por medição
da área de lesão. Os linfócitos dos linfonodos poplíteos drenantes da lesão (LNs) foram
analisados por citometria de fluxo (FACS - fluorescence-activated cell sorting) e por
ressonância plasmônica de superfície (SPR - surface plasmon resonance). Os resultados de
FACS indicaram que o perfil de linfócitos é definido na primeira semana de infecção e
caracterizado por elevados níveis de linfócitos B e por uma diminuição de linfócitos T. O
percentual de linfócitos B foi três vezes maior quando comparado com o dos camundongos
não infectados e os linfócitos T eram 1,5 vezes mais baixo. Estes valores permaneceram
constantes ao longo da infecção até o ultimo ponto analisado. Foi observado um discreto
aumento (0.3 a 0.5) na relação CD8+/CD4+ nos animais infectados, enquanto nos não
infectados esta relação permaneceu em torno de 0.35, até o último dia do estudo.
Adicionalmente, nós realizamos ensaios de detecção de linfócitos T CD8+ dos LNs, em tempo
real, por SPR, utilizando moléculas H-2 Ld:Ig ligadas à peptídeos da região COOH-terminal de
cisteína-proteinase B de L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5=
EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). Os peptídeos
testados indicaram valores de constante de associação (0.16x107 – 22.0x107) e dissociação
(0.047-0.123) favoráveis a formar complexos com os dímeros H-2 Ld em pH neutro, com
valores de energia livre de Gibbs < 0. De forma geral, a ligação das células ao complexo
H-2 Ld:Ig/peptídeo, mostrou uma resposta (RU - Response unit) de dissociação maior em
células de animais infectados (113 RU – 465 RU) que nas dos animais não infectados (71 RU
– 304 RU). A resposta aos complexos H-2 Ld:Ig/peptídeo revelou diferenças de
reconhecimento nas semanas avaliadas, como alta resposta ao P1.10 (227 RU) na 3ª
semana e ausência de resposta ao P1.7 na 16ª semana. Em uma mesma semana de análise,
vimos que o nível de reconhecimento dos peptídeos difere entre eles, uns apresentando alto
valor de RU e outros um valor mais baixo: 3ª (P1.10>P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4ª
(P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6ª (P6.4>P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12ª
(P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18ª semana (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Embora, apenas, dois
peptídeos tenham sido testados na 1ª semana, a maior resposta foi relacionada ao P1.7 (161
RU), seguido do P1.9 (115 RU). Os dados gerados indicaram uma flutuação na população
dos linfócitos T e B, assim como o envolvimento de linfócitos T CD8+ direcionados a
peptídeos da região COOH-terminal da CPB, ao longo da infecção / In this study, we performed a kinetic ex vivo monitoring of host immune responses during
murine infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis. Female BALB/c mice were
injected subcutaneously in the left hind footpad with 106 promastigotes in stationary growth
phase and the progression of infection was monitored by measuring lesion area expansion.
Lymphocytes from lesion draining popliteal lymph nodes (LNs) were analyzed by
fluorescence-activated cell sorting (FACS) and surface plasmon resonance (SPR). FACS
results indicated that the lymphocytes profile is defined in the first week post infection and was
characterized by high levels of B cells and by a decrease in T cell numbers. The percentage of
B lymphocytes was three times higher when compared to the non-infected mice and T
lymphocytes were up to 1.5 times lower. These values remained constant throughout infection
until the last point analyzed. It was observed a slight increase (0.3 to 0.5) in the CD8+/CD4+
ratio in the infected mice, whereas in the not infected group this ratio remained around 0.35,
until the last assessed infection day. Additionally, we have performed an assay to detect CD8+
T lymphocytes from LNs in real time, by SPR, utilizing H-2 Ld:Ig molecules bound to peptides
derived from the COOH-terminal region of cysteine-proteinase B from L. (L.) amazonensis
(P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9=
MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). The peptides tested presented values of association
(0.16x107 – 22.0x107) and dissociation constant (0.047-0.123) favorable to form complexes
with H-2 Ld at neutral pH, with values of Gibbs free energy < 0. In general, the binding of cells
to the H-2 Ld:Ig/peptide complexes showed a response unit (RU) of dissociation higher in cell
preparations from infected mice (113 RU - 465 RU) than the cells from uninfected mice (71 RU
– 304 RU). The recognition response to the complex H-2 Ld:Ig/peptide were assessed at
different weeks as high response to P1.10 (227 RU) at 3th week and absence of response to
P1.7 at 16th week. In the same week of analysis, we found that the level of recognition of
peptides differs among them, some presenting a high value of RU and others a lower value:
3th (P1.10 >P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4th (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6th (P6.4>
P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12th (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18th week
(P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Although only two peptides were tested at 1th week, the
highest response was related to P1.7 (165 RU), followed by P1.9 (115 RU). Generated data
indicated a fluctuation in the population of T and B lymphocytes, as well as the involvement of
CD8+ T cells directed to peptides of the COOH-terminal region of the CPB, throughout the
infection
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6934 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Silveira Júnior, Lenilton Silva da |
| Contributors | Gaspar, Ana Maria Coimbra, Mendonça, Sergio Coutinho Furtado de, Leon, Leonor Laura Pinto, Amaral, Verônica Figueiredo do, Silva, Fátima Conceição, Cavalcanti Júnior, Geraldo Barroso, Alves, Carlos Roberto |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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