β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04112011-092208 |
| Date | 03 October 2011 |
| Creators | Bragatto, Ivan |
| Contributors | Terra, Clelia Ferreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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