Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa,
ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria,
cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de
detergentes, papelera, y de biocombustibles.
En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son
principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia
compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4
glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico
que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la
biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias
y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura,
el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas
mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa.
En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para
termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la
estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium
usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la
introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante
diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y
por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática
utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos
para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR
con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos
mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y
la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las
variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y
fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas
en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P.
pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con
concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k.
La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se
llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser
analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad
asociada a ellas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/171111 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Aranda Soto, Natalia Beatriz |
| Contributors | Lienqueo Contreras, María Elena, Stange Klein, Claudia |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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