Human neurocysticercosis (NC) is an important but neglected cause of epilepsy in
developing countries where the parasite occurs. Expression of single-chain variable fragment
(scFv) antibodies on the surface of bacteriophage is widely used to prepare antibodies with
pre-defined specificities. A phage antibody library was selected against peptides displayed
on phages coupled to beads and total saline extract of Taenia solium metacestodes
immobilized on microtiter plate wells. After two rounds of selection 96 phage clones of each
panning were selected, tested for scFv expression and specificity to each target. Specific
clones were further analyzed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), Dot-blot,
sequencing and immunofluorescence. After selection, three clones were used for antigen
capture to characterize its targets for future immunodiagnostic assays development. Total
saline extract was fractionated on ion exchange resin diethylaminoethyl (DEAE), and
fractions were tested by ELISA to detect sera IgG from: NC, other parasites and health
controls (40 each). The fractions with best diagnostic parameters (sensitivity, specificity,
area under curve and likelihood ratio, calculated by TG-ROC) were selected and subjected to
antigen capture using each purified scFv clone. Each captured fraction was tested by ELISA
to detect IgG in 30 serum samples from each group. In immunofluorescence tests, no
fluorescence was observed in negative controls, and all clones showed a non-uniform
staining profile, and their targets were elucidated through mass spectrometry. After ion
exchange fractionation and ELISA tests, DEAE S2 fraction showed to be the best one and
was used to capture new antigens. DEAE S2 showed 93.3% specificity. Among all clones,
A4 and B6 captured antigens from saline extract and DEAE S2 fraction, respectively, with
the best diagnostic parameters. In conclusion, antibody phage display technology is a
potential approach for the study of antigen-antibody interactions, which can be used to
further elucidate the biology of interaction on neurocysticercosis and to capture new antigens
with potential applications in NC diagnosis and therapeutics. / A neurocistocercose humana (NC) é uma doença muito importante, porém
negligenciada e é a maior causa de epilepsia em países em desenvolvimento onde a
parasitose ocorre. A expressão de fragmentos de cadeia única das regiões variáveis de
anticorpo (scFv) na superfície de bacteriófagos é amplamente utilizada para obter anticorpos
com especificidades pré-definidas. Uma biblioteca de anticorpos foi utilizada para a seleção
de clones específicos à peptídeos expostos em fagos acoplados a beads e ao extrato salino
total de Taenia solium (S) imobilizado em placas de microtitulação. Após dois ciclos de
seleção, 96 clones de anticorpos foram selecionados contra cada alvo, testados para
expressão do scFv e especificidade pelo alvo. Aqueles clones que se mostraram específicos
foram melhor analisados por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), Dot blot,
sequenciamento e imunofluorescência. Três clones foram selecionados para serem utilizados
na captura antigênica e caracterização do antígeno verdadeiro e para captura de novos
antígenos com potencial aplicação em testes diagnósticos. O extrato S foi fracionado em
resina de troca iônica diethylaminoethyl (DEAE) para obter frações que foram
posteriormente testadas por ELISA para detectar IgG em amostras de soro de pacientes: com
NC, outras parasitoses e saudáveis, 40 amostras cada grupo. A fração com melhores
parâmetros diagnósticos (sensibilidade, especificidade, área sob a curva e likelihood ratio,
calculadas por TG-ROC) foi selecionada e sujeita à captura antigênica usando cada clone de
scFv purificado. Cada fração capturada foi testada por ELISA para detectar IgG em 30
amostras de soro de cada grupo. Nos testes de imunofluorescência, nenhuma fluorescência
foi observada com os controles negativos e todos os clones mostraram um padrão de
marcação não uniforme, seus antígenos alvo foram elucidados por espectrometria de massas.
Após fracionamento por troca iônica e ELISA, a fração DEAE S2 se mostrou a melhor e foi
utilizada para a captura de novos antígenos. A fração DEAE S2 mostrou especificidade de
93,3%. Dentre todos os clones, o A4 e o B6 capturaram antígenos do extrato S e fração
DEAE S2, respectivamente, com os melhores parâmetros diagnósticos. Em conclusão a
tecnologia de exposição de anticorpos em fagos é uma técnica potencial para o estudo de
interações antígeno-anticorpo utilizadas para melhor elucidar a a biologia da interação na NC
e para capturar novos antígenos potencialmente aplicáveis para o diagnóstico da NC. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/16574 |
| Date | 06 July 2012 |
| Creators | Ribeiro, Vanessa da Silva |
| Contributors | Goulart Filho, Luiz Ricardo, Costa-cruz, Julia Maria, Souza, Guilherme Rocha Lino de, Cunha Junior, Jair Pereira da, Oliveira, Heliana Batista de, Cardoso, Rone |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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