O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-25032015-133924 |
| Date | 10 December 2014 |
| Creators | Gabriela Mól Avelar Tamaki |
| Contributors | Suely Lopes Gomes, Frederico José Gueiros Filho, Rosana Puccia, Nilce Maria Martinez Rossi, Aline Maria da Silva |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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