Ingeniero Civil en Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la gran demanda de proteínas recombinantes y en particular de anticuerpos para el uso terapéutico en humanos, se busca optimizar los cultivos celulares para obtener mayor producción de proteínas y menores costos de producción. Uno de los métodos utilizados en el mejoramiento de los cultivos es la ingeniería celular donde, mediante la inserción o eliminación de un gen, se modifican las vías metabólicas de las células. Las líneas celulares animales tienen la desventaja de que su metabolismo es incapaz de oxidar la glucosa completamente a CO2 y H2O. La mayor parte de la glucosa, es oxidada a piruvato y finalmente a lactato, el que tiene un impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de proteínas.
El trabajo consistió en caracterizar los clones CHO MDHII y CHO PYC generados a partir de una línea celular CHO productora de IgG, que sobreexpresan los genes MDHII y PYC2 las cuales han mostrado mejorar la eficiencia del metabolismo en otras líneas celulares, produciendo menos lactato y aumentando el flujo de carbonos desde la glicólisis hacia el ciclo del TCA. Para ello fue necesario hacer una selección previa de clones, de tal forma de escoger a los que presentaran mayor productividad específica de IgG y mayor eficiencia metabólica, caracterizada por valores bajos de producción de lactato por glucosa consumida (ΔL/ΔG). Luego se procedió a realizar las curvas de crecimiento para los clones y las células CHO wild-type que se utilizó como control. Para la caracterización del metabolismo, se midió la glucosa consumida, la producción de lactato, IgG y amonio, y se calcularon las tasas de consumo y producción de los metabolitos. La caracterización de la expresión transcripcional se realizó mediante un PCR en tiempo real, para el que fue previamente necesario extraer el RNA de las muestras, seguida de la síntesis de cDNA.
Los resultados mostraron una menor producción de biomasa y anticuerpo IgG en los clones en comparación al control CHO wild-type, debido a un aumento inesperado en la producción de este último. Por otro lado, sí fue posible demostrar una mayor eficiencia metabólica de los clones debido a la disminución en la producción de lactato, en el caso del clon CHO MDHII y a una menor diferencia entre las tasas de producción de lactato y consumo de glucosa, en el clon CHO PYC. Al comparar las eficiencias de ambos clones, las células CHO MDHII mostraron una mayor eficiencia metabólica lo que se debería a un mayor flujo de carbonos desde la glicólisis al ciclo del TCA. Se cree que el clon CHO PYC no mostró una mayor eficiencia metabólica debido a que se generaría una acumulación de malato que no podría ser procesada por la enzima MDHII en el ciclo del TCA. Los cálculos de productividad específica de IgG demostraron que la producción de proteína recombinante estaría asociada al crecimiento celular y se cree que el consumo de glutamina cumpliría un rol importante en la producción de biomasa e IgG debido a que se obtuvieron mayores concentraciones de amonio en las células con mayor densidad y producción de proteína.
El análisis de la expresión transcripcional no permitió detectar diferencias en la amplificación de los genes MDHII y PYC2, principalmente debido a la variación en los resultados obtenidos y a que no fue posible amplificar un producto específico para el gen PYC2.
Del trabajo se puede concluir que el clon CHO MDHII presentó una mayor eficiencia metabólica debido a la menor producción de lactato y exhibió mayor producción de biomasa e IgG que el clon CHO PYC.
Para comprender mejor el comportamiento de estos clones, se debe llevar a cabo un estudio de los flujos en las vías metabólicas y buscar métodos de cultivo que optimicen el crecimiento celular y la producción de proteína, para obtener el máximo beneficio de los clones. Por otro lado, es importante que en el proceso de la selección de clones, la productividad de proteína recombinante de los clones se compare con una muestra control, de tal manera de verificar que estos presentan una mejora. Además se deben seleccionar los clones que presenten una mayor densidad celular y menor producción de lactato, ya que se ha visto que estas características mejoran la productividad.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113039 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Baldecchi Montaner, Alessandra Francesca |
| Contributors | Gerdtzen Hakim, Ziomara, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, Andrews Farrow, Bárbara, Salazar Aguirre, María Oriana |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
Page generated in 0.0021 seconds