Un polypeptide néosynthétisé est capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tri-dimensionnelle finale, en passant par des intermédiaires partiellement structurés. L'acquisition d'information sur le rôle et l'importance de ces intermédiaires est rendue difficile parce qu'ils se forment très rapidement pendant la réaction de repliement et que cette période de temps n'est pas accessible aux appareils de mélange usuels.<br />L'objet de cette thèse était de caractériser les évènements cinétiques initiaux du repliement des protéines, notamment de l'apomyoglobine (apoMb), en utilisant des appareils de mélange ultra-rapide. Un appareil de type stopped-flow équipé d'une micro-cuve a permis de diminuer le temps mort de ce type de mélangeur. Une réaction bimoléculaire (NATA et NBS), à permis d'évaluer le temps mort à 400±10 µs, dans un mode d'utilisation permettant de suivre simultanément le signal de fluorescence et le signal de dichroïsme circulaire dans l'UV lointain. L'apoMb est une protéine particulièrement intéressante pour l'étude des évènements précoces du repliement des protéines. Le stopped-flow ultra rapide, a permis de suivre des cinétiques (k jusqu'à 1500 s-1) et montré que chaque étape précédemment identifiée, conduisant l'apoMb de sa forme dépliée à sa forme native (soit les réactions UIa, IaIb, et IbN), présente les caractéristiques typiques d'une réaction à deux états, hautement coopérative.<br />Nous avons étudié l'effet d'osmolytes sur les cinétiques et sur la stabilité à l'équilibre des formes U, I et N de l'apoMb. Des études cinétiques en présence de sucrose ont permis d'observer le comportement de la réactions UIa. Ces résultats indiquent que le sucrose déstabilise de manière relative la forme U et l'état de transition de la réaction UIa, par rapport à la forme Ia. L'étape limitante ne correspondrait donc pas à une compaction de la chaîne peptidique. Dans les mêmes conditions, l'étude de la transition IbN permet d'observer que l'état de transition présente des caractéristiques proches de Ib. Ces résultats, décrivant l'effet osmophobique sur l'intermédiaire I, ainsi que des résultats préliminaires de l'effet d'encombrement moléculaire sur le repliement du cytochrome C, sont discutés dans ce mémoire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00178851 |
| Date | 07 January 2005 |
| Creators | Weisbuch, Sébastien |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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