Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais se organizam em filamentos e estruturas de maior nível de organização. Em humanos são encontrados 13 genes que codificam septinas, as quais se dividem em 4 grupos com base na similaridade de sua organização estrutural. Análises filogenéticas identificaram quatro septinas ortólogas no deuterostômio Ciona intestinalis, as quais apresentam, cada uma, identidade com um dos quatro grupos de septinas de mamíferos. Tais proteínas foram nomeadas CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 e CiSEPT9 devido a identidade com as septinas humanas. Sabe-se que septinas de diferentes grupos interagem entre si formando heterocomplexos e, assim, a possibilidade de formar um oligômero único em C. intestinalis permite um modelo mais simples para o estudo da organização dos filamentos. Análises de bioinformática identificaram nessas proteínas motivos estruturais típicos de septinas, incluindo resíduos conservados para a ligação e hidrólise do GTP. As proteínas foram produzidas de forma heteróloga e a capacidade hidrolítica tanto de CiSEPT2 como de CiSEPT7 foiram confirmadas diretamente. Em contrapartida, CiSEPT6 não apresentou atividade catalítica. Um sistema de coexpressão foi construído no qual as quatro septinas de C. intestinalis foram co-expressas e co-purificadas em diferentes arranjos, resultando na formação de heterocomplexos parciais além daquele contendo as quatro subunidades. A avaliação do estado oligomérico dos heterocomplexos parciais mostrou que estes correspondem majoritariamente a tetrâmeros e hexâmeros quando formados, respectivamente, por duas ou três subunidades. Estes oligômeros foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em que se observou que os mesmos se dispõem na forma de um bastão. Ensaios ainda mostraram que a polimerização desses oligômeros é dependente de CiSEPT2 sugerindo que esta subunidade esteja possivelmente posicionada na extremidade do heterocomplexo. Adicionalmente, ensaios de polimerização realizados com o complexo CiSEPT2/6/7/9 revelaram que este é capaz de interagir com filamentos adjacentes, possivelmente via coiled-coil, formando estruturas de mais alta ordem, similar aos já observados em S. cerevisiae. Finalmente, experimentos utilizando termoforese em microescala (MST) mostraram uma maior afinidade de interação entre as subunidades quando oligômeros estão envolvidos, indicando que estes podem atuar como fator de nucleação para a formação dos heterocomplexos. Esse trabalho apresenta os primeiros estudos de caracterização das septinas de C. intestinalis mostrando a formação do heterocomplexo e representa um modelo simplificado e viável para estudos estruturais relativos a formação de filamentos de septinas. Assim, através de uma abordagem comparativa com complexos oriundos de outros organismos, este novo complexo poderá contribuir para a compreensão do mecanismo de montagem e controle da polimerização de septinas. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other forming heterocomplexes, filaments and higher order structures. The human genome encodes 13 septins, which are divided into 4 subgroups based on sequence similarity. Phylogenetic analysis demonstrated that only a single representative of each of these subgroups is present in the non-vertebrate chordate Ciona intestinalis. These proteins are named CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 and CiSEPT9 due to their great similarity with human septins. Once septins from different subgroups are able to interact among themselves to form hetero-oligomeric complex, C. intestinalis representatives can be used as a simpler model for studies of septin complex assembly. Bioinformatics analysis identified typical structural motifs of septins in these proteins, including conserved residues for binding and hydrolysis of GTP. These septins were expressed and characterized biophysically and biochemically revealing that CiSEPT2 and CiSEPT7 are capable of hydrolyzing GTP. In contrast, CiSEPT6 showed no catalytic activity. A coexpression system were designed in which the four septins of C. intestinalis were co-expressed and co-purified in different arrangements, resulting the formation of partial heterocomplexes in addition to that containing the four subunits. The oligomeric state of the partial heterocomplexes were confirmed corresponding to tetramer and hexamers when formed, respectively, by two or three subunits. Transmission electron microscopy analysis revealed that these oligomers assemblies are rod-like structures. The polymerization of these oligomers is dependent on CiSEPT2 suggesting that this subunit occupies possibly the terminal positions of the heterocomplex. Additionally, polymerization assays performed with the CiSEPT2/6/7/9 complex revealed that it is capable of interacting with adjacent filaments, possibly via coiled-coil, forming higher order structures similar to those already reported in S. cerevisiae. Finally, the interaction strenght among C. intestinalis septins were determined using microscale thermoforesis (MST), revealing a higher binding affinity when titration involves small oligomers instead of monomers, indicating that these may act as a nucleating factor for heterocomplex assembly. This work constitutes the first characterization of C. intestinalis septins presenting the heterocomplex assembly and represents a simplified and potential model for structural studies regarding the filaments assembly of septins. Thus, comparative studies involving complexes from other organisms may contribute to the understanding of the assembly mechanism and polymerization control of septins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28082019-153549 |
| Date | 24 April 2019 |
| Creators | Morais, Sinara Teixeira do Brasil |
| Contributors | Araujo, Ana Paula Ulian de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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