Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée
par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le
rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation
des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur
la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats
démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20-
40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations
d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la
durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se
lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations
d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant
négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste
DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de
ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une
inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de
fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors
que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs.
Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à
évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite
par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc,
préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum
d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30
min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée.
Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant
d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet
protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de
l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant
tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit
cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du
récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons
donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du
DOR soit survenue. / Opioids are the most effective analgesics available but their use is limited by
tolerance. Tolerance is related, at least in part, to receptor desensitization. Hence, the
role of the present study was to better characterize the desensitization process, in
particular concerning the role of the tyrosine kinase Src on regulation of delta opioid
receptor signalling. Our results show that pharmacological inhibition with PP2
(administered at low concentration: 20-40µM) or molecular inhibition of the kinase
with low expression levels of a dominant negative mutant of Src (0,2µg of DNA)
potentiate the magnitude and duration of agonist-dependent (DPDPE; 1µM; 5 min)
activation of the ERK pathway. We also showed that higher concentrations of Src
inhibitors (80 and 100µM of PP2 or 1µg/ml of dominant negative mutant DNA)
block the MAPK cascade following DOR stimulation by DPDPE. These
observations indicate that Src has a biphasic effect on ERK activity, respectively
potentiating or inhibiting agonist stimulation of the MAPK cascade at low and high
levels of Src inhibition. We reasoned that high levels of Src blockers were interfering
with ERK activation mechanism while low levels of inhibition were interfering with
receptor desensitization. This possibility was tested by using cAMP accumulation
assays to evaluate the effect of Src blockers (PP2, 20 µM; 1h) on agonist-induced
desensitization. DOR stimulation by DPDPE inhibited forskolin stimulated cAMP
production in a dose dependent manner with a maximal reduction of 61%. This
inhibitory response was reduced by 72% following pre-exposure to DPDPE (1 µM,
30 min), an effect that was blocked by pre-treating cells with PP2 (PP2, 20 µM; 1 h)
before desensitization. The protective effect of Src blockers did not involve changes
in DOR internalization but interfering with internalization by using an
internalization-deficient DOR mutant or hypertonic medium (0.4M sucrose) reduced
this protection, indicating the need for optimal internalization in order for the
protective effect of Src blockers to take place. Based on the latter observation it was
possible to conclude that Src contribution to DOR desensitization is post-endocytic.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/8851 |
| Date | 07 1900 |
| Creators | Gobeil, Mélanie P. |
| Contributors | Pineyro, Graciela |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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