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Previous issue date: 2009-04-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are proteins that inhibit specifically cysteine peptidases. The Canecystatin 1 gene which codifies a protein containing 106 amino acids residues was identified in sugarcane and possesses significant similarity with Oryzacystatin, a cystatin from rice. In order to obtain a cystatin with improved activity, direct evolution experiments were carried out. A DNA shuffling library was constructed using these two cystatins. One clone named A10PL3 obtained from these shuffled cystatins was selected, expressed in E.coli, purified and an analyzed by activity assays. These results showed that the activity of hybrid protein A10PL3 increased, in particular regarding its inhibitory activity on cathepsin B compared with its two precursors. The present study aimed to revert the changes of individual clone A10PL3 through site-directed mutations, generating three mutant cystatins: Mutant I (Thr17Ile), Mutant II (Gln 84Leu) and Mutant III (Thr17Ile); (Gln84Leu). Assays for inhibitory activity against the human cathepsins B and L were performed. Structural studies were also made by means of molecular modeling of proteins by homology that were enabled to understand the molecular mechanisms related to improvement of the inhibitory activity of these cystatins. These studies therefore corroborate with the observed data previously which demonstrated the improvement of specific protein A10PL3 in cathepsin B inhibition (Ki 16 nM) in relation to their parents. The mutants I, II and III, did not present improvement in inhibitory activity against cathepsin B. The structural studies revealed that the mutations performed on cystatin A10PL3 destabilized the hydrophobic core making it more flexible, thus increasing the inhibitory activity on cathepsin B. The absence of interactions underlying the hydrophobic core resulted in a trend of lower solubility, probably due to their inability to adopt a compact formation, which resulted in the exposure of some residues which are part of that core, which can lead to aggregation and also contribute to increasing the flexibility of cystatin, influencing their inhibitory activity. / Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno peptidases. A canacistatina 1, uma proteína com 106 resíduos de aminoácidos, apresenta grande similaridade com a proteína Orizacistatina 1, uma cistatina de arroz. Com o objetivo de se obter uma cistatina com a atividade inibitória melhorada, experimentos de evolução molecular direta de proteínas foram realizados, através da construção de uma biblioteca de DNA shuffling usando estas duas cistatinas. Um clone denominado A10PL3 foi selecionado, expresso, purificado e submetido a ensaios de inibição de atividade enzimática. Foi demonstrado que a proteína A10PL3 exibiu aumento da atividade inibitória contra catepsina B humana em comparação com seus dois precursores. O presente estudo teve como objetivo reverter as alterações do clone A10PL3 através de mutações sítio-dirigidas, gerando mais três cistatinas mutantes: Mutante I (Thr17Ile), Mutante II (Gln 84 Leu) e Mutante III (Thr17Ile); (Gln84Leu). Ensaios de atividade inibitória dos mutantes contra as catepsinas humanas B e L foram realizados. Além disso, foram desenvolvidos estudos estruturais por meio de modelagem molecular de proteínas por homologia que permitiram a compreensão dos determinantes moleculares relacionados à melhoria da atividade inibitória destas cistatinas. Os resultados aqui apresentados são importantes, pois corroboram com os dados observados anteriormente, demonstrando a melhora na especificidade da atividade inibitória da proteína A10PL3 contra a catepsina B (Ki = 16 nM) em relação aos seus parentais. Os mutantes I, II e III não foram capazes de inibir a catepsina B. Os estudos estruturais revelaram que as mutações na cistatina A10PL3 desestabilizaram o núcleo hidrofóbico provavelmente tornando a região N-terminal da proteína mais flexível, influenciando a atividade inibitória contra a catepsina B. A desestabilização do núcleo hidrofóbico resultou na tendência de uma menor solubilidade, provavelmente devido à sua tendência de expor resíduos que fazem parte desse núcleo, o que pode levar à agregação e também contribuir para o aumento da flexibilidade da cistatina.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/252 |
| Date | 30 April 2009 |
| Creators | Dellamano, Marcia |
| Contributors | Silva, Flávio Henrique da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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