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Previous issue date: 2015-09-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In view of the alarming scenario of visceral leishmaniasis in Brazil and in the world, especially due to the increasing number of cases of drug resistance and due to the few drugs available, it is essential to search for new therapeutic alternatives for this parasitosis. The complete sequencing of the genome of the main species of Leishmania opened great possibilities in understanding these diseases and initiated the post-genomic era of drug discovery against kinetoplastids. In this context, the enzyme 14 a-sterol demethylase (CYP51) of Leishmania is especially involved in the biosynthesis of ergosterol, the main sterol membrane and vital to the parasite. Furthermore, it was recently shown that inhibition of CYP51 of L. donovani is essential for the growth of the parasite, and therefore, is a validated target for the development of new leishmanicidal drugs. The aim of this work was the development and implementation of integrated strategies in medicinal chemistry to identify new bioactive compounds against L. infantum using CYP51 enzyme as molecular target. For this, we compiled, integrated and prepared the largest publicly available data sets related to CYP51 and phenotypic assays for Leishmania infantum amastigotes. Virtual screening models (VS) were constructed and extensively validated and applied to filter over 1 million of commercial compounds. The best models for VS were ROCS (LBDD) and pharmacophore (SBDD), with an area under the ROC curve (AUC) values of 0.86-0.90. The consensus between the two models had greater performance, with AUC of 0.93 and high recognition ability active ligands in the top 1% hits. Quantitative structure-activity relationship (QSAR) models robust and predictive were generated and validated for L. infantum (amastigote forms). The models were able to discriminate inactive active compounds with correct classification rate (CCR) values of 0.77 to 0.95 when evaluated for the external validation set. After the virtual screening, QSAR models were used to assist in the final selection of the compounds to be experimentally evaluated. This strategy allowed the identification of 12 compounds that were selected and acquired for in vitro assays against Leishmania (L.) infantum (MHOM / BR / 1972 / LD) in promastigote and amastigote forms, and determination of selectivity/cytotoxicity in NCTC in mammalian cells. Of the twelve compounds tested, six of them showed 50% inhibitory concentration (IC50) values raging from 3.48 to 58.94 μM and were more potent than the standard drug meglumine antimoniate, which is the drug of choice for the treatment of all forms of leishmaniasis. Three most promising compounds (LabMol-007, LabMol-009 and LabMol-012), had activity in leishmanicidal as amastigote and selectivity index promising (IC50 < 5.21 μM and selectivity index > 6.8) and were selected as new hits. We analyzed the parasite metabolic changes in the presence of known CYP51 inhibitors and new inhibitors using HR-MAS NMR 1H . We observed major changes in the energetic metabolism, amino acids catabolism, sterol biosynthesis, purine biosynthesis and thiol-redox system of the parasite. The three hit compounds identified in this work will continue in the drug development process, being necessary to carry out in vivo studies, elucidation of the mechanism of action, hit optimization, as well as the study of pharmacokinetic properties and toxicity. / Tendo em vista o quadro alarmante da leishmaniose visceral no Brasil e no mundo, especialmente devido ao crescente número de casos de resistência e aos poucos medi- camentos disponíveis, é imprescindível a busca de novas alternativas terapêuticas para esta parasitose. O sequenciamento completo do genoma das principais espécies de Leish- mania abriu grandes possibilidades no entendimento desses organismos e iniciou a era pós-genômica da descoberta de fármacos contra tripanossomatídeos. Nesse contexto, destaca-se a enzima 14 a-esterol desmetilase (CYP51) de Leishmania, que é especial- mente envolvida na biossíntese do ergosterol, principal esterol de membrana e vital para o parasito. Além disso, recentemente foi demonstrado que a inibição da CYP51 de L. donovani é essencial para o crescimento do parasito, sendo, portanto, um alvo validado para o desenvolvimento de novos fármacos leishmanicidas. O objetivo geral deste trabalho foi o desenvolvimento e a aplicação de estratégias integradas em Química Medicinal para a identificação de novas substâncias bioativas contra L. infantum, utilizando a enzima CYP51 como alvo molecular. Para isso, foram compilados, integrados e preparados os maiores conjuntos de dados disponíveis publicamente relacionados a CYP51 e a ensaios fenotípicos para Leishmania spp. Modelos de triagem virtual (VS) foram construídos, exaustivamente validados e aplicados para filtrar uma quimioteca com mais de 1 milhão de compostos comerciais. Os melhores modelos para a VS foram o ROCS (LBDD) e o farmacofórico (SBDD), com valores de área sob a curva ROC (AUC) de 0,86-0,90. O consenso entre esses dois modelos foi superior com valor de AUC de 0,93 e alta capacidade de reconhecimento de ligantes ativos no topo de 1% hits. Modelos de relação quantitativa entre estrutura e atividade (QSAR) robustos e preditivos foram gerados e validados para um conjunto de dados de compostos com atividade contra L. infantum (formas amastigota). Os modelos de QSAR foram capazes de discriminar compostos ati- vos de inativos com uma taxa de acerto (CCR) de 0,77-0,95, quando avaliados utilizando o conjunto de validação externa. Após a triagem virtual, os modelos de QSAR foram usados para auxiliar na seleção final dos compostos a avaliados experimentalmente. Essa estratégia permitiu a identificação de 12 compostos que foram selecionados e adquiridos para realização de ensaios de atividade biológica in vitro contra Leishmania (L.) infantum (MHOM/BR/1972/LD) em formas promastigotas e amastigotas, e determinação de sele- tividade/citotoxidade em células mamíferas NCTC. Dos doze compostos testados, seis deles apresentaram valores de concentração inibitória de 50% (IC50) entre 3,48-58,94 μM e foram mais potentes que o fármaco padrão antimoniato de meglumina, que é o fármaco de primeira escolha para o tratamento de todas as formas de leishmaniose. Três compostos mais (LabMol-007, LabMol-009 e LabMol-012) tiveram atividade em leishmanicida na forma amastigota e índice de seletividade bastante promissores (IC50 < 5,21 μM e índice de seletividade > 6,8) e foram selecionados como novos hits. Analisou-se as alterações metabólicas do parasito na presença inibidores conhecidos de CYP51 e dos novos inibi- dores, empregando-se RMN HR-MAS 1H. Foram observadas alterações principais nas vias de metabolismo energético, catabolismo de aminoácidos, biossíntese de esteróis, metabolismo purinas e no sistema tiol-redox do parasito. Os três hits identificados neste trabalho prosseguirão no processo de desenvolvimento de novos fármacos, sendo necessá- ria a realização de estudos in vivo, elucidação do mecanismo de ação, otimização dos hits, além do estudo de propriedades farmacocinéticas e toxicidade.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/6276 |
| Date | 18 September 2015 |
| Creators | Braga, Rodolpho de Campos |
| Contributors | Lião, Luciano Morais, Andrade, Carolina Horta, Lião , Luciano Morais, Andrade , Carolina Horta, Andrade , Nelilma Correira, Silva , Vinícius Barreto da, Guimarães , Freddy Fernandes |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Química (IQ), UFG, Brasil, Instituto de Química - IQ (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 663693921325415158, 600, 600, 600, 600, 7826066743741197278, 1571700325303117195, 2075167498588264571 |
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