Einleitung: Bei generalisierten Dystonieformen, gekennzeichnet durch abnorme Haltungen und Verdrehungen infolge unwillkürlicher Muskelkontraktionen, kommt häufig die Tiefe Hirnstimulation (THS) im Globus pallidus internus (Nucleus entopeduncularis, EPN, in Nagern) zum Einsatz. Die Entwicklung rationaler Therapieansätze bzw. die Optimierung der THS ist durch mangelnde Kenntnisse zur Pathophysiologie sowie zum Wirkmechanismus der THS bei Dystonien erschwert. Veränderungen der neuronalen Plastizität innerhalb der Basalganglienschleife scheinen hierbei allerdings eine entscheidende Rolle zu spielen. Einen wichtigen Modulator der neuronalen Plastizität stellen die perineuronalen Netze (PNs) dar, welche sich um die Zellsomata und proximalen Dendriten von Neuronen, insbesondere Parvalbumin-reaktiven (PV+) Interneuronen, befinden. Ein wichtiger Bestandteil dieses kondensierten Subtyps der extrazellulären Matrix (EZM) sind die Chondroitinsulfat-Proteoglykane, wie Aggrecan und Brevican. Während die Rolle einer abnormen PN-Expression in der Pathophysiologie der Dystonien weitgehend unbekannt ist, konnte bei einer Form der paroxysmalen Dyskinesie des Hundes mit dystonen Symptomen ein Defekt im Brevican-Gen gefunden werden. Somit könnten die PNs auch an der Pathophysiologie der Dystonien beteiligt sein. Ziele der Untersuchungen: Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Hypothese nachgegangen, dass die basale Expression von Brevican in Dystoniemodellen verändert ist und PN pathophysiologische Bedeutung bei Dystonien haben. Da Veränderungen der PN durch elektrische Impulse ein wichtiger Mechanismus der THS darstellen könnte, wurde im zweiten Teil untersucht, ob eine antidyston wirksame THS mit Veränderungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) und Brevican-Expression einhergeht. Tiere, Material und Methoden: Als phänotypisches Modell der paroxysmalen Dystonie wurde der dtsz Hamster genutzt, bei dem wahrscheinlich die Reifung von PV+ Interneuronen verzögert ist. Die DYT1 Knock-in Maus, die keine dystonen Symptome zeigt, ist ein ätiologisches Modell für eine permanente generalisierte Dystonieform. In beiden Tiermodellen wurde die Brevican-Expression immunhistochemisch mittels Intensitätsmessungen und Zellzählung von Brevican-exprimierenden PV+ Neuronen untersucht: dtsz Hamster (n = 8; Kontrolltiere n = 5) bzw. DYT1 KI-Maus (n = 9, Kontrolltiere n = 8). Zudem erfolgten im Mausmodell (je n = 6) Untersuchungen der Proteine mittels Western Blot und der mRNA-Expression (qPCR). Weiterhin wurde nach EPN-THS mit 130 Hz (antidyston wirksam) bzw. 40 Hz (Tendenz zu antidystonen Effekten) sowohl Brevican als auch c-Fos in dtsz und Kontrollhamstern vs. sham-Stimulationen (je n = 8 dtsz, n = 5 Kontrolltiere) untersucht. Die graphische Darstellung und statistische Auswertung mittels t-Test bzw. ANOVA erfolgte mit SigmaPlot (Signifikanzniveau von 5 % (p ≤ 0,05)). Ergebnisse: Der Vergleich von dtsz vs. Kontrollhamster ergab interessante (basale) Unterschiede innerhalb des Basalganglien-Netzwerks. So zeigte sich eine geringere Anzahl Brevican-positiver Zellen an der Gesamtzahl PV+ Zellen (Brev+/PV+) im motorischen Cortex und an striatalen schwach PV+ Interneuronen, während die Brevican-Intensitäten im Striatum und dem ventromedialen Thalamus erhöht waren. Die Untersuchungen in der DYT1 KI-Maus ergaben hingegen nur eine subtile Erhöhung von Brevican im motorischen Cortex. Eine dreistündige THS im dtsz Hamster (vs. sham) führte nicht zu Veränderungen von Brevican, die basalen Genotyp-Veränderungen bestätigten sich jedoch. Erhöhungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) nach EPN-THS zeigten sich nahe der Elektrodenspitze und eine Verringerung in den tiefen Cerebellarkernen nach 130 Hz EPN THS. Schlussfolgerungen: Im dtsz Hamstermodell könnte eine Entwicklungsstörung der PN an der verzögerten Ausreifung der PV+ Interneurone beteiligt sein. Die weiteren Veränderungen stimmen mit bekannten regionalen Störungen im Basalgangliennetz überein. Allerdings bleibt unklar, ob sie Ursache der Dystonie oder Folge anderer Veränderungen darstellen. Die nur kurze, dreistündige THS hatte keine weitreichenden Effekte auf die neuronale Aktivität und Brevican. Stärkere Effekte sind auch eher bei den noch laufenden Langzeit-THS Versuchen über 10 Tage bei dtsz Hamstern zu erwarten. Die basalen Brevican-Veränderungen bei der dtsz Mutante zeigten sich nicht im asymptomatischen DYT1 KI-Mausmodell, bei dem die corticale Erhöhung der Anzahl Brev+/PV+ jedoch ein Grund für sensomotorische Störungen sein könnte. Brevican ist somit zwar nicht generell vermindert, jedoch in beiden Dystoniemodellen verändert, so dass weiterführende Untersuchungen zur pathophysiologischen Bedeutung von Brevican sowie anderen PN Komponenten, wie HAPLN4 und Aggrecan, sinnvoll erscheinen.:1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Dystonien
2.1.1 Definition und Einteilung
2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien
2.1.2.1 Neuronale Plastizität
2.1.2.2 Neuronale Aktivität
2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien
2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS)
2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie
2.1.4.1 dtsz Hamstermutante
2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell
2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze
2.2.1 Aufbau und Funktion
2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten
2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen
2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit
3 Tiere, Material, Methoden
3.1 Tiere
3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern
3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen
3.2 Material
3.3 Methoden
3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster
3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere
3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse
3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme
3.3.5 Immunhistochemie (IHC)
3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin
3.3.5.2 c-Fos
3.3.5.3 Aggrecan
3.3.6 Western Blot (WB)
3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion
3.3.6.2 Durchführung Western Blot
3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation
3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR
3.3.8 Statistische Auswertung
3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC
3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB
3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR
4 Ergebnisse
4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster
4.1.1 Intensität von Brevican
4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen
4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell
4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen
4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.2.3 Western Blot
4.2.4 qPCR
4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS)
4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz
und Kontrollhamstern
4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen
4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen
4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS)
4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden
4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen
4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze
4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
5 Diskussion
5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik
5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie
5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot
5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR
5.2 Diskussion der Ergebnisse
5.2.1 Brevican im dtsz Hamster
5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus
5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster
5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster
5.3 Bedeutung und Ausblick
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang / Introduction: Deep brain stimulation (DBS) in the globus pallidus internus (nucleus entopeduncularis, EPN, in rodents) is frequently used in generalized forms of dystonia, characterized by abnormal postures and contortions due to involuntary muscle contractions. The development of rational therapeutic approaches or optimization of DBS is hampered by a lack of knowledge about the pathophysiology as well as the mechanism of action of DBS in dystonia. However, changes in neuronal plasticity within the basal ganglia loop seem to play a crucial role in this regard. An important modulator of neuronal plasticity is represented by the perineuronal nets (PNs) located around the cell somata and proximal dendrites of neurons, particularly parvalbumin-reactive (PV+) interneurons. An important component of this condensed extracellular matrix (ECM) subtype are chondroitin sulfate proteoglycans, such as aggrecan and brevican. While the role of abnormal PN expression in the pathophysiology of dystonia is largely unknown, a defect in the brevican gene was found in a form of canine paroxysmal dyskinesia with dystonic symptoms. Thus, PNs may also be involved in the pathophysiology of dystonia. Aims of the studies: Therefore, the first part of this work addressed the hypothesis that basal expression of brevican is altered in dystonia models and PNs have pathophysiological significance in dystonia. Because changes in PN by electrical stimuli may represent an important mechanism of DBS, the second part examined whether antidystonic DBS is associated with changes in neuronal activity (c-Fos) and brevican expression. Animals, Materials, and Methods: The dtsz hamster, in which maturation of PV+ interneurons is probably delayed, was used as a phenotypic model of paroxysmal dystonia. The DYT1 knock-in mouse, which does not show dystonic symptoms, is an etiologic model for a permanent generalized form of dystonia. In both animal models, brevican expression was examined immunohistochemically using intensity measurements and cell counting of brevican-expressing PV+ neurons: dtsz hamster (n = 8; control animals n = 5) and DYT1 KI mouse (n = 9, control animals n = 8), respectively. In addition, examination of protein (western blot) and mRNA expression (qPCR) were performed in the mouse model (n = 6 each). Furthermore, after EPN-DBS at 130 Hz (antidystonic effects) or 40 Hz (tendency to antidystonic effects), both brevican and c-Fos were examined in dtsz and control hamsters vs. sham stimulation (n = 8 dtsz each, n = 5 control animals). Graphical representation and statistical analysis using t-test and ANOVA, respectively, were performed using SigmaPlot (significance level of 5% (p ≤ 0.05)). Results: Comparison of dtsz vs. control hamsters revealed interesting (basal) differences within the basal ganglia network. For example, there was a lower number of brevican-positive cells to total PV+ cells (Brev+/PV+) in motor cortex and striatal weakly PV+ interneurons, while brevican intensities were increased in striatum and ventromedial thalamus. In contrast, the studies in the DYT1 KI mouse revealed only a subtle increase in brevican in the motor cortex. Three-hour DBS in the dtsz hamster (vs. sham) did not result in changes of brevican, but the basal genotype changes were confirmed. Increases in neuronal activity (c-Fos) after EPN-DBS were seen near the electrode tip and a decrease in deep cerebellar nuclei after 130 Hz EPN-DBS. Conclusions: In the dtsz hamster model, developmental disruption of the PN may be involved in the delayed maturation of PV+ interneurons. The other changes are consistent with known regional disturbances in the basal ganglia network. However, it remains unclear whether they represent a cause of the dystonia or a consequence of other changes. DBS, which was only brief and lasted three hours, had no widespread effects on neuronal activity and brevican. Stronger effects are also more likely after the long-term DBS which is still ongoing for 10 days in dtsz hamsters. The basal brevican changes in the dtsz mutant were not evident in the asymptomatic DYT1 KI mouse model, in which the cortical increase in Brev+/PV+ number could, however, be a cause of sensorimotor dysfunction. Thus, although brevican is not generally decreased, it is altered in both dystonia models, so further studies on the pathophysiological significance of brevican as well as other PN components, such as HAPLN4 and aggrecan, seem reasonable.:1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Dystonien
2.1.1 Definition und Einteilung
2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien
2.1.2.1 Neuronale Plastizität
2.1.2.2 Neuronale Aktivität
2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien
2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS)
2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie
2.1.4.1 dtsz Hamstermutante
2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell
2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze
2.2.1 Aufbau und Funktion
2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten
2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen
2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit
3 Tiere, Material, Methoden
3.1 Tiere
3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern
3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen
3.2 Material
3.3 Methoden
3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster
3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere
3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse
3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme
3.3.5 Immunhistochemie (IHC)
3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin
3.3.5.2 c-Fos
3.3.5.3 Aggrecan
3.3.6 Western Blot (WB)
3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion
3.3.6.2 Durchführung Western Blot
3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation
3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR
3.3.8 Statistische Auswertung
3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC
3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB
3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR
4 Ergebnisse
4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster
4.1.1 Intensität von Brevican
4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen
4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell
4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen
4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.2.3 Western Blot
4.2.4 qPCR
4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS)
4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz
und Kontrollhamstern
4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen
4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen
4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen
4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS)
4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden
4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen
4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze
4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
5 Diskussion
5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik
5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie
5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot
5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR
5.2 Diskussion der Ergebnisse
5.2.1 Brevican im dtsz Hamster
5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus
5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster
5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster
5.3 Bedeutung und Ausblick
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:86011 |
| Date | 13 June 2023 |
| Creators | Lüttig, Anika |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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