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Previous issue date: 2017-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The genus Citrus contains a wide variety of fruit-producing species such as oranges, lemons, limes and mandarins that are highly popular in the world. Brazil is one of the main citrus producers, currently leading the world production of oranges. The Brazilian citrus industry is extremely important because of it is great activity that generates jobs, thus contributing to the socioeconomic development of the country. However, the genetic background used in the Brazilian citriculture is still very narrow, with few varieties being cultivated commercially. This is a reflection of the fact that there is still a great difficulty in obtaining superior individuals through traditional breeding due to the limitations presented by the citrus crop. This makes it necessary to develop new technologies, especially those that exploit the already sequenced genomes. One of these technologies is the genome editing, where it is possible to make disruptions in specific points in the genome of a given organism, leading to mutations or substitutions of DNA fragments. Among the various techniques used for genome editing, CRISPR / CAS9 is the most promising because of its ease of use. With its first studies in 2013, there is an increasing number of papers showing CRISPR / CAS9 mediated genome editing in different organisms, including plants. At the present time, for citrus there are works of two groups in which this technology was used to generate mutant plants. Therefore, the application of this technology could be better exploited to take citrus studies in Brazil to another level, with prospects of generation of new varieties. Thus, this project had a central objective to optimize systems for generation of mutants via CRISPR / CAS9 in citrus. In order to explore the existing methodologies for genome editing in plants, constructs of vectors with targets in genes of interest for the study of disease resistance were made using vectors available in the literature. From this initial work, it was possible to propose two improvements for optimization of the process: the use of transient transformation to identify mutations and consequent efficiency of the CRISPR vector and the construction of a new vector for plant genome editing. We were able to evaluate some parameters and to optimize the methodology of transient transformation in sweet orange, resulting in an average of up to 93% of transformed leaf discs. It was also possible to conclude the construction of a new vector for plant genome editing that has the advantages of having reduced size, easy customization in the vector itself and resistance to kanamycin in plants and bacteria. The advances obtained in this work can be applied in studies of several areas not only of citrus, but also of other cultures. / O gênero Citrus abrange uma grande diversidade de espécies produtoras de frutas como laranjas, limões, limas e tangerinas que são altamente populares no mundo. O Brasil é um dos principais produtores de citros, liderando a produção mundial de laranjas. A citricultura brasileira é de extrema importância pois é uma grande atividade geradora de emprego, contribuindo assim para o desenvolvimento socioeconômico do país. Entretanto, a base genética utilizada na citricultura brasileira é ainda muito estreita, com poucas variedades sendo cultivadas comercialmente. Isto é reflexo de ainda existir uma grande dificuldade na obtenção de indivíduos superiores através do melhoramento tradicional, pelas limitações apresentadas pela cultura dos citros. Isto faz com que seja necessário o desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente aquelas que exploram os genomas já sequenciados. Uma destas tecnologias é a edição de genomas, onde se realiza disrupções em pontos específicos do genoma de um determinado organismo, levando a mutações ou substituições de fragmentos de DNA. Dentre as várias técnicas utilizadas para edição de genomas, CRISPR/CAS9 é a que tem se mostrado a mais promissora, pela facilidade de utilização. Com início de aplicação em 2013, há um número crescente de trabalhos mostrando edição de genoma mediada por CRISPR/CAS9 em diferentes organismos, incluindo plantas. Até o presente momento, para citros existem trabalhos de dois grupos nos quais esta tecnologia foi utilizada para gerar plantas mutantes. Portanto, a aplicação desta tecnologia poderia ser melhor explorada para levar estudos de citros no Brasil a um outro patamar, com perspectivas de geração de novas variedades. Assim, este projeto teve como objetivo central otimizar sistemas para geração de mutantes via CRISPR/CAS9 em citros. Afim de explorar as metodologias existentes para edição de genoma em plantas, foram feitas construções de vetores com alvos em genes de interesse para o estudo de resistência de doenças utilizando-se vetores disponíveis na literatura. A partir deste trabalho inicial, foi possível propor duas melhorias para otimização do processo: o uso de transformação transiente para identificação de mutações e consequente eficiência do vetor CRISPR, e a construção de um novo vetor para edição de genomas de plantas. Fomos capazes de avaliar alguns parâmetros e otimizar a metodologia de transformação transiente em laranja doce, resultando em uma média de até 93% de discos foliares transformados. Também foi possível finalizar a construção de um novo vetor para edição de genomas de plantas que possui as vantagens de ter tamanho reduzido, fácil customização no próprio vetor e resistência a canamicina em plantas e bactérias. Os avanços obtidos nesse trabalho poderão ser aplicados em estudos de diversas áreas não só de citros, mas também de outras culturas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/9253 |
| Date | 31 August 2017 |
| Creators | Bernardi, Amanda de Carvalho |
| Contributors | Takita, Marco Aurélio |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus Araras, Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal e Bioprocessos Associados (Campus ARARAS), UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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