Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do organismo contra microrganismos invasores, células infectadas com vírus e células tumorais. Em seres humanos saudáveis eles constituem a população de células brancas mais abundantes do sangue. O reconhecimento de componentes microbianos por neutrófilos desencadeia a fagocitose, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e liberação de proteínas granulares, tais como mieloperoxidase (MPO) e elastase (NE). Essas EROs e enzimas agem como agentes microbicidas e contribuem para os processos inflamatórios. Em trabalho anterior constatamos um aumento da atividade do sistema NADPH oxidase fagocítico (NOX2) e da geração de EROs por neutrófilos de ratos diabéticos e não diabéticos tratados com aminoguanidina (AG), um conhecido inibidor da formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs), que culminou num aumento da atividade microbicida destas células. Nosso objetivo é elucidar o mecanismo de ação pelo qual a AG está atuando no nosso modelo. Desta forma, neste trabalho, avaliamos a hipótese que a AG estaria estimulando a degranulação de neutrófilos, portanto, estudamos a modulação da MPO e da NE, principais enzimas presentes nos grânulos azurófilos de neutrófilos. Para isso, utilizamos neutrófilos humanos isolados a partir de sangue periférico colhido por punção venosa de voluntários sadios. Os neutrófilos foram incubados ou não com AG 0,5 mM por um período de 18 horas em estufa de cultivo celular. A atividade de MPO foi avaliada através da formação de HOCl e através de quimiluminescência amplificada por luminol. A atividade de NE foi avaliada através da formação do produto da reação p-nitroanilida, por espectrofotometria. Avaliamos também a expressão da MPO e NE por Western blotting e imunomarcação. Como controle das reações foi utlizado inibidor de MPO (azida) e de NE (inibidor de tripsina de glycine max (soybean) - (STI)). O isolamento de neutrófilos permitiu obter uma população celular com mais de 95% de neutrófilos, com viabilidade superior a 99%. Nossos resultados mostraram que a AG não foi capaz de influenciar a atividade de cloração e basal da MPO, porém, observamos um aumento de ERO pelo tratamento com a AG após estímulo. Vimos também que a atividade de NE permaneceu inalterada pelo tratamento com a AG. Além disso, a AG não interferiu na expressão e distruibuição da MPO e NE. Estes resultados em conjunto nos levam a sugerir que a AG não influencia diretamente no processo de degranulação de neutrófilos, uma vez que este processo é um mecanismo utilizado por fagócitos com o propósito de criar um ambiente totalmente hostil para patógenos invasores. Aparentemente, o aumento da atividade microbicida de neutrófilos tratados com AG, não é via NE ou MPO na atividade clássica desta enzima, ou seja, na produção de HOCl. Entretanto, vimos uma resposta importante na atividade de MPO, que nos permite propor várias atividades para esta enzima, ora como uma atividade oxidativa que pode contribuir para o killing, ora como uma atividade antioxidante e desta forma pode proteger outras proteínas granulares antimicrobianas dos danos oxidativos. / Neutrophils represent the organism´s first line of defense against invading microorganisms, infected cells with viruses and tumor cells. In healthy humans, they constitute the most abundant population of white blood cells. The recognition of microbial components by neutrophils initiate phagocytosis, generation of reactive oxygen species (ROS) and release of granular proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and elastase (NE). These ROS and enzymes act as microbicidal agents and contribute to the inflammatory processes. In a previous study, we found an increase in phagocyte NADPH oxidase system activity (NOX2) and generation of ROS by neutrophils of diabetic rats and non-diabetics treated with aminoguanidine (AG), a known inhibitor of the formation of advanced glycation end products (AGEs), which resulted in an increased microbicidal activity of these cells. Our aim is to elucidate the mechanism of action by which AG is acting in our model. This way, this study evaluated the hypothesis that AG would be stimulating degranulation of neutrophils, therefore, we studied the modulation of MPO and NE, the main enzymes present in azurophilic granules of neutrophils. For this, we used human neutrophils isolated from peripheral blood collected by venipuncture from healthy volunteers. Neutrophils were incubated or not with AG 0,5 mM for a 18 hour period in cell culture incubator. MPO activity was evaluated through the formation of HOCl and luminol-amplified chemiluminescence. NE activity was evaluated through the formation of the product of p-nitroanilide reaction, by spectrophotometry. We also evaluated the expression of MPO and NE by western blotting and immunostaining. As control of reactions was used inibitor of MPO (azide) and of NE (trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) - (STI)). The neutrophil isolation allowed the achievement of a cell population with over 95% of neutrophils, with viability greater than 99%. Our results showed that AG was not capable of influencing the chlorination and basal activity of MPO, however, an increase of ROS by the treatment with AG after stimulation was noted. We also noted that NE activity remained unaltered by the treatment with AG. In addition, AG did not affect expression and distribution of MPO and NE. These results together lead us to suggest that AG does not influence directly the process of neutrophils degranulation, as this process is a mechanism used by phagocytes in order to create a fully hostile environment for invading pathogens. Apparently, the increase of microbicidal activity of neutrophils treated with AG is not via NE or MPO in the classical activity of this enzyme, in other words, in the production of HOCl. However, we observed a significant response in MPO activity, allowing us to propose various activities for this enzyme, either as a oxidative activity that can contribute to the killing or as an antioxidant activity, and therefore may protect other antimicrobial granular proteins from oxidative damage. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/945 |
| Date | 16 February 2016 |
| Creators | LIMA, Tayra Ferreira Oliveira de |
| Contributors | RODRIGUES, Maria Rita, http://lattes.cnpq.br/6136249880386507, BRUNETTI, Iguatemy Lourenço, PAULA, Fernanda Borges de Araújo |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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