Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización
de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías
dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o
desórdenes inflamatorios.
Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las
células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal,
vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la
interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos
descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana
corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas
para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito.
El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que
median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT,
en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello
se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en
modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por
su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad
antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina
inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta.
Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si
TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de
células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2.
Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la
quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la
interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el
efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs.
Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata
en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento
capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar
in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana,
mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio
claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281
y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante
experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y
células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la
proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de
apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal
con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas
en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante
experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células
EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en
forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula
humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína.
Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación
de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos.
En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal
en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo
sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la
morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la
internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por
infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents
capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood
supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders.
Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell.
It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin,
interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to
laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T.
cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay,
which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with
several strains of the parasite.
The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular
mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible
role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT
shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic
effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their
proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT),
and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment.
The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits
angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic
rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative
effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on
endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if
TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the
TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent
manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20-
191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis
experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with
HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the
human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281
and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we
demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line.
The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and
time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were
observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar
concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells
migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind
to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this
interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR
experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate
the antiangiogenic gene expression.
In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on
arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo
and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration
inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These
properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions
induced by trypanosomic infections
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105162 |
| Date | January 2008 |
| Creators | López Bartolucci, Nandy Carolina |
| Contributors | Ferreira Vigouroux, Luís, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Escuela de Graduados |
| Publisher | Universidad de Chile, CyberDocs |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | López Bartolucci, Nandy Carolina |
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