Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-16T20:24:05Z
No. of bitstreams: 1
2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Enzimas deubiquitinantes (DUBs) desempenham um papel importante na regulação da degradação de proteínas e de outros processos não-degradativos, por desconjugação de ubiquitina (Ub) de proteínas marcadas, como a modulação da resposta imune, a sinalização da quebra da dupla fita do DNA e endocitose. Explorar o papel de deubiquitinação em Leishmania infantum demonstra uma alternativa promissora para procurar novos alvos terapêuticos para a leishmaniose, já que a quimioterapia utilizada é onerosa, tóxica e tende a ser ineficiente. Este estudo teve como objetivo o estabelecimento de duas linhagem de L. infantum expressando uma cópia extra de otubaína (OtuLi), caracterização da atividade enzimática e funcional da OtuLi recombinante produzida em E. coli (rOtuLi). Com relação ao estabelecimento das linhagens, o gene otuli foi amplificado, clonado no vetor pLEXSY-hyg2 e linearizado. Os promastigotas de L. infantum foram transfectados com os cassetes e selecionados. A integração dos cassetes ao locus gênico da 18S rRNA foi confirmada por PCR e a expressão da OtuLi fusionada ao peptídeo FLAG ou a cauda de 6 histidinas foi verificada por western blot. A citolocalização da FLAG-OtuLi indica que a enzima encontra-se em pequenas vesículas no citoplasma da célula com fortes marcações perto da região do cinetoplasto, corroborando o resultado visto utilizando anticorpos específicos para a OtuLi. A OtuLi não co-localiza com a mitocôndria marcada por duas sondas diferentes e com o retículo endoplasmático imunomarcado pela Proteína Dissulfato Isomerase em promastigotas. A rOtuLi apresentou atividade em pH ácido com substrato de tetra-ubiquitina ligado pela lisina 48 e o perfil de inibição indica que os inibidores NEM e Ub-aldeído são capazes de inibi-la. Através de mutações sítio-dirigidas realizadas na OtuLi, foi observado que tanto os resíduos próximos ao sítio catalítico quanto aqueles envolvidos na interação com a ubiquitina ocasionaram mudanças estruturais, conforme dinâmica molecular, resultando na redução ou perda da atividade da enzima. A rOtuLi foi capaz de estimular a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoniais e induzir a secreção de IL-6 e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias. O estabelecimento das linhagens com a cópia extra de otuli representa o primeiro passo para futura identificação de proteínas capazes de interagir com a OtuLi e assim, elucidar seu mecanismo de ação no parasito. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Deubiquitylating enzymes (DUBs) play an important role in regulating protein degradation and other non-degradative processes, by deconjugation of ubiquitin (Ub) from marker proteins, such as immune response modulation, signalling of double strand breaks at DNA and endocytosis. Exploring the role of deubiquitination in Leishmania infantum demonstrates a promising alternative to search for new therapeutic targets for leishmaniasis, since its primary chemotherapy is expensive, toxic and tending to be inefficient. This study aimed to establish two L. infantum strains expressing an extra copy of otubain (OtuLi), characterization of enzymatic and functional activity of recombinant OtuLi (rOtuLi). Regarding the establishment of the strains, the otuli gene was amplified, cloned in pLEXSY-hyg2 and the vector was linearized. The promastigotes of L. infantum were transfected with the cassette and selected. The integration of the cassettes into the 18S rRNA gene locus was confirmed by PCR and the expression of OtuLi fused to the FLAG peptide or to a 6 histidine tail was accessed by western blot. The citolocalization of FLAG-OtuLi indicates that the enzyme is in small vesicles in the cytoplasm of the cell with strong markings near the kinetoplast region, confirming the results seen using antibodies specific for OtuLi. The OtuLi is not co-located with the mitochondria marked by two different probes and with the endoplasmic reticulum immunolabeled by protein disulfide-isomerase. The rOtuLi showed activity at acid pH with lysine 48-linked tetra-ubiquitin substrate and the inhibition profile indicates that NEM and Ub-aldehyde inhibitors are able to inhibit it. Through site-directed mutations in OtuLi, it was observed that the residues near the catalytic site or those involved in the interaction with the ubiquitin caused structural changes as shown by molecular dynamics, resulting in a reduction or loss of enzyme activity. The rOtuLi was able to stimulate the formation of lipid body in peritoneal macrophages and to induce the secretion of IL-6 and TNF-α, pro-inflammatory cytokines. The establishment of these strains with the extra copy of otuli is the first step for future identification of proteins that interact with OtuLi and thus elucidate its mechanism of action in the parasite.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/21398 |
| Date | 08 July 2016 |
| Creators | Azevedo, Clênia dos Santos |
| Contributors | Bastos, Izabela Marques Dourado |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0025 seconds