Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2004 / Resumo: A mioglobina é uma hemeproteína que tem a função de transportar e armazenar o oxigênio. Suas estruturas primária e secundária são compostas por 153 aminoácidos e oito a-hélices (nomeadas de A-H), respectivamente. Esta proteína tem sido usada como um bom modelo para estudos de estrutura, função, ligação de heme, estabilidade e enovelamento de proteínas. Em condições ligeiramente ácidas (pH em torno de 4), a apomioglobina se desenovela passando por uma forma intermediária que possui propriedades físicas entre o estado nativo (pH 7) e o estado desenovelado (pH 2). Este intermediário apresenta as hélices A, G e H protegidas como demonstrado por experimentos de troca de deutério. No presente trabalho, foram realizados estudos com mutantes de deleção e de permutações circulares de hélices da mioglobina com a finalidade de aumentar o conhecimento sobre como a estrutura terciária de uma proteína é construída. Três classes de mutantes foram criadas: 1) deleção de hélices: 1.1) um mutante de deleção da hélice H (Mb1-123) e 1.2) um mutante de deleção das hélices G e H (Mb1-99); 2) permutações circulares: 2.1) um mutante de permutação da hélice A da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb-B_GHA) e 2.2) um mutante de permutação das hélices A e B da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb- C_GHAB) e 3) permutação com deleção: um mutante de deleção da hélice G com
permutação da hélice H da extremidade C-terminal para N-terminal (Mb-HAB_F). As proteínas mutantes foram purificadas diretamente na forma apo, embora estes mutantes possuam capacidade de se ligar ao grupo heme, com exceção do mutante Mb1-123. Estes mutantes possuem valores mais baixos de elipticidade molar e tendência maior à agregação do que a proteína selvagem. Quando na forma holo, os dois mutantes circularmente permutados são compactos e têm estrutura e função semelhantes à holoMbWT. Este resultado difere do resultado observado para as variantes de deleção (Mb1-99 e Mb-HAB_F) que não apresentaram restabelecimento da estrutura e nem supressão da tendência à agregação. Nossos resultados indicam que, embora a mioglobina possua um núcleo de ligação do grupo heme, as hélices A, B, G e H são necessárias para a correta arquitetura da proteína. Apesar da menor estabilidade dos mutantes de permutação circulares em relação à proteína selvagem, as extremidades N- e Cterminais da mioglobina são necessárias para que a proteína alcance uma estrutura estável e funcional semelhante à selvagem. As permuteínas estruturaram a forma intermediária mesmo em pH ao redor de 7, mostrando novamente que as extremidades N- e C- terminais de mioglobina são necessárias para que elas se estruturem como a selvagem. Acreditamos que um núcleo, que se mostrou insensível ao novelamento em meio ácido, foi formado nestes mutantes. Como estes mutantes diferem quanto à posição da hélice B, eles permitiram inferir sobre a participação da hélice B no intermediário
de ApoMbWT. Duas formas de intermediários estão provavelmente presentes na via de enovelamento da mioglobina e suas maiores diferenças parecem estar na quantidade de estrutura formada pela hélice B. Nossos resultados estão de acordo com o modelo seqüencial de enovelamento para mioglobina, no qual a hélice B é incorporada após a formação do domínio AGH / Abstract: Myoglobin functions as a protein for transporting and storing oxygen and is a soluble, globular heme-binding protein, comprising 153 amino acids arranged in
eight helical segments (named A to H). This protein has been used as a good model to study structure, function, heme binding, stability, and folding pathway. Under mild acid conditions (pH 4), apomyoglobin unfolds through an intermediate form with physical properties intermediate between the native (neutral pH) and the unfolded (pH 2.0) states. This intermediate has helices A, G and H protected from hydrogen exchange. Here we present studies of deleted and circularly permuted mutations of helical blocks of myoglobin to add to our understanding of how protein topology is built. Three classes of mutants were constructed: 1) helix deletion: 1.1) a mutant deleted of H helix, Mb1-123, and 1.2) a mutant deleted of G and H helices, Mb1-99; 2) circularly permutation: 2.1) Mb-B_GHA where B-helix is N-terminal and A helix is C-terminal, and 2.2) Mb-C_GHAB where C-helix is N-terminal and B helix is Cterminal;
3) permutation/deletion: a deleted circularly permutation where H-helix is N-terminal, the G helix is deleted, and the F helix is C-terminal, Mb-HAB_F. The mutants were purified in the apo form, where although they have the ability to bind heme with an exception to Mb1-123, they have lower ellipticity and a larger tend ency to aggregate than the wild-type. When in the holo form, the two circularly permuted mutants are compact and have native-like function and conformation, different form the myoglobin variants of deletion (i.e. Mb1-99 and Mb-
HAB_F), where the heme binding does not seem to be native-like and do not suppresses their tendency to aggregate. Our results indicate that although myoglobin has a core that is able to bind heme, the A, G, H and B helices are needed for the correct structural architecture of the protein. And, since the circularly permutations are less stable than the wild-type, the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. The apopermuteins resembled the intermediate form even at physiological pH, showing again that the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. We believe that a nucleus, mostly independent of acid unfolding, was formed by these mutants and, since these permutants differ in the position of the B helix, they gave insights about the participation of the B helix in the intermediate. Two forms of intermediates are likely to be present in the folding pathway of apomyoglobin and their major difference seems to be in the amount of structure in the B helix. Our results agreed with a model of sequencial folding for apomyoglobin where the B helix is added later in the AGH nucleus / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314023 |
| Date | 17 March 2004 |
| Creators | Ribeiro Junior, Euripedes de Almeida |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-, Bonafé, Carlos Francisco Sampaio, Pessine, Francisco Benedito Teixeira, Santoro, Marcelo Matos, Farah, Shaker Chuck |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 132p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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