Biotransformação é uma estratégia promissora para a descoberta de novas moléculas de interesse farmacêutico e industrial. Fungos têm demonstrado habilidade para biotransformar muitas moléculas naturais e sintéticas. Um produto natural muito estudado e de potencial para a indústria farmacêutica é o Lapachol, uma naftoquinona que apresenta uma ampla diversidade de atividades biológicas. Existem na literatura muitos estudos de biotransformação utilizando fungos, mas pouco se sabe sobre como esses microrganismos transformam essas moléculas, e quais proteínas e vias metabólicas estão envolvidas nesses processos. A proteômica tornou-se uma das principais abordagens para analisar e compreender os sistemas biológicos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi compreender o processo de biotransformação do lapachol pelo fungo Phanerochaete chrysosporium, identificando os biotransformados, suas atividades biológicas e investigando o proteoma do fungo durante o bioprocesso a fim de identificar as proteínas e as vias metabólicas envolvidas. O fungo foi capaz de biotransformar o lapachol e gerou dois análogos, um já teve sua estrutura elucidada e é inédita na literatura. O proteoma intracelular foi analisado por eletroforese bidimensional e, após análises quanti e qualitativas, as proteínas selecionadas foram submetidas à espectrometria de massas por MALDI-TOF/TOF. Após análises, com a ferramenta de bioinformática BLAST2GO, determinou-se que as enzimas identificadas hiperabundante e ou exclusivas da condição lapachol estavam principalmente envolvidas com processos de detoxicação e resposta ao estresse oxidativo. Além disso, foram detectadas diversas enzimas com atividade de oxirredução. Além do mais, a técnica de Shotgun LC-MS/MS foi realizada. A identificação e quantificação (label-free) das proteínas foram feitas através da análise de dados MS/MS brutos pelo software MaxQuant/Andromeda. As diferenças nas expressões das proteínas identificadas entre os grupos foram computadas usando o software Perseus. Este estudo foi capaz de identificar um total de 221 proteínas intracelulares e 28 extracelulares, sendo que 54 proteínas intracelulares e 4 proteínas extracelulares foram estatisticamente diferentes ou únicas para uma condição (lapachol ou controle). Manganês-peroxidase e ?-glicosidase, ambas enzimas com interesse biotecnológico, foram identificadas exclusivas e aumentada, respectivamente na condição lapachol, desssa forma, o lapachol pode ser um bom agente pró-oxidante, pois estimulou a produção dessas enzimas oxidativas. Époxido desidrogenase e álcool desidrogenase parecem estar envolvidas na rota de biotransformação do lapachol, a primeira catalisando a abertura do epóxido e a segunda, reduzindo regioseletivamente carbonilas. O derivado PC01 mostrou-se mais tóxico para células de adenocarcinoma mamário que o lapachol e 3 e 5 vezes menos tóxico para células epiteliais normais que cisplatina e lapachol, respectivamente, mostrando-se um composto promissor. Esta é a primeira vez que a proteômica foi utilizada para investigar a biotransformação do lapachol. / Biotransformation is a promising strategy to discovery of new molecules with pharmaceutical and industrial interest. Fungi have demonstrated the ability to biotransform many natural and synthetic molecules. A very studied natural product of potential for the pharmaceutical industry is Lapachol, a naphthoquinone with a great diversity of biological activities. There are many biotransformation studies in the literature using fungi but little is known about how these microorganisms transform these molecules, which proteins and metabolic pathways are involved in these processes. Proteomics has become one of the main approaches for analyzing and understanding biological systems. The objective of the present study was to understand the biotransformation process of lapachol by Phanerochaete chrysosporium, identifying the biotransformed and its biological activities and investigating the fungus proteome during the bioprocess to identify the proteins and the metabolic pathways involved. After 24 h of bioprocessing, the fungus was able to biotransform lapachol and generated two analogues, one already had its structure elucidated and is unpublished in the literature. The intracellular proteome was analyzed by two-dimensional electrophoresis and, after quantitative and qualitative analyzes, the selected proteins were submitted to MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. After analysis, with the BLAST2GO bioinformatics tool, it was determined that the enzymes identified as hyperabundant and exclusive to the lapachol condition were mainly involved with detoxification and oxidative stress response processes. Moreover, several enzymes with oxreduction activity were detected. In addition, the Shotgun LC-MS/MS technique was performed on intracellular and extracellular proteins. Identification and quantification (label-free) of the proteins were performed by the analysis of MS/MS raw data using MaxQuant/Andromeda software. Differences in the expressions of the proteins identified between the groups were computed using Perseus software. This study was able to identify a total of 221 intracellular and 28 extracellular proteins. 54 intracellular proteins and 4 extracellular proteins were different or unique statistics for a condition (lapachol or control). Manganese-peroxidase and ?-glycosidase, both enzymes of biotechnological interest, were identified exclusively and increased respectively in the lapachol condition, thus, lapachol may be a good pro-oxidant agent, since it stimulated the production of these oxidative enzymes. Epoxide dehydrogenase and alcohol dehydrogenase appear to be involved in the lapachol biotransformation route, the first catalyzing the epoxide opening and the second, regioselectively reducing carbonyls. The PC01 derivative was shown to be more toxic to mammary adenocarcinoma cells than lapachol and approximately 3 to 5 times less toxic to normal epithelial cells than cisplatin and lapachol, showing a promising compaund. To our best knowledge, this is the first time that proteomics has been used to investigate the biotransformation of lapachol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23052019-085523 |
| Date | 10 August 2018 |
| Creators | Coitinho, Luciana Barbosa |
| Contributors | Cabral, Hamilton |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0025 seconds