As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. Schistosomiasis mansoni also known as water belly or snail´s disease is a chronic parasitic illness that affects approximately 207 million people worldwide with approximately 6 million in Brazil. Schistosomiasis is treated by the use of drugs that are not-in fact effective for the eradication of the disease, and although their efficiency cause serious side effects. In addition, there are reports of S. mansoni´s resistant strains to these drugs, thus justifying the search for new drugs. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the de novo pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathways for its purine requirement. Thus this study aimed to determine the catalytic constants and three-dimensional structure of MTAP (EC 2.4.2.28), an enzyme that is involved in purine salvation pathway, and is thus essential to the reproduction of the parasite. The MTAP was heterologously expressed, purified and crystallized. The protein was submitted to kinetic assays in coupled system, to determine the catalytic constants. The protein was crystallized in 100mM Bis-tris or MES pH 6.1-6.5 and 14-18% PEG 3350. The crystals were submitted to diffraction of rays-X in the LNLS and DLS. Data sets were obtained, processed, refined and analyzed. Structures were obtained in apoenzyme form complexed with fosfate, complexed with adenine and sulfate, complexed with tubercidin and sulfate, and with adenine and glycerol in a space group different of the others. Through the secondary structure, it was possible to analyze the active site and obtained preliminary information of the catalytic mechanism of the target enzyme. This study contributes to the complete elucidation of the purine salvation pathway in S. mansoni, and provides basic information for the research of the new drugs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01062012-171148 |
| Date | 16 April 2012 |
| Creators | Souza, Juliana Roberta Torini de |
| Contributors | Pereira, Humberto D\'Muniz |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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