Neste trabalho, demonstramos a fabricação de microambientes tridimensionais para investigar o crescimento celular. Inicialmente, desenvolvemos um sistema de microfabricação que utiliza fotopolimerização via absorção de dois fótons, com o qual se pode fabricar um conjunto de microestruturas com formas e espaçamentos pré-determinados. Este sistema de fabricação utiliza pulsos de femtossegundos, provenientes de um laser de Ti:safira operando em 790 nm. A intensidade destes pulsos é alta o bastante para induzir a absorção de dois fótons no fotoiniciador, o qual é responsável por promover a polimerização em uma resina acrílica. A natureza não linear da absorção de dois fótons confina a excitação ao volume focal, permitindo a fabricação de estruturas tridimensionais com alta resolução espacial. Para a obtenção dos microambientes, foi necessário o desenvolvimento de um sistema opto-mecânico de movimentação, tanto do feixe quando do substrato da amostra. Com esta técnica, fabricamos microambientes compostos de estruturas com diferentes formas (paralelepípedos, cilindros e cones) e espaçamentos, os quais foram caracterizados através de microscopia óptica e eletrônica. Para demonstrar a viabilidade destes microambientes para a investigação do crescimento celular, estes foram utilizados para monitorar o desenvolvimento da célula Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7), uma linhagem celular de adenocarcinoma de mama que apresenta fenótipo tumoral amplamente utilizada como modelo de estudo para câncer de mama. Observamos, via microscopia óptica de transmissão e fluorescência, o desenvolvimento das células MCF-7 nos distintos microambientes. Nossos resultados indicam uma melhor aderência e, portanto, desenvolvimento celular nas microestruturas cilíndricas. Observamos ainda uma maior densidade de células nos microambientes com estruturas separadas de 12 µm, a qual diminui com o aumento do espaçamento, de tal forma que para o microambiente com 30 µm, por exemplo, poucas células são observadas. Portanto, nossos resultados demonstram que os microambientes desenvolvidos são viáveis para estudos mais aprofundados em biologia celular, com potenciais aplicações em engenharia de tecido. / In this work we have demonstrated the fabrication of tridimensional microenvironments for the investigation of cell growth. Initially we have developed a two-photon absorption photopolymerization microfabrication system, which allows producing a set of microstructures with predetermined forms and spacing. This fabrication system uses femtosecond pulses from a Ti: sapphire laser operating at 790 nm. These pulses are intense enough to induce two-photon absorption by the photoinitiator, that is responsible for promoting the polymerization in an acrylic resin. The nonlinear nature of the two-photon absorption confines the excitation to the focal volume, allowing the fabrication of tridimensional structures with high spatial resolution. In order to obtain the microenvironments, it was necessary to develop a movement system for both the laser beam and the sample substrate. With this technique we have fabricated microenvironments composed by structures with different geometries (parallelepipeds, cylinders and cones) and spacing, which were characterized by optical and scanning electron microscopes. To demonstrate the feasibility of the microenvironments for the investigation of cell growth, the samples were used to monitor de development of the Michigan Cancer Foundation-7 cell (MCF-7), a lineage of breast adenocarcinoma that has a tumoral phenotype and is highly used as a model in breast cancer studies. We have observed, through conventional optical and fluorescence microscopy, the growth of the MCF-7 cells in the various microenvironments. Our results indicate a better adhesion and, therefore, better development of cells on the cylindrical microstructures. We also observe a higher cell density in the microenvironments with microstructures having a spacing of 12 µm, which reduces as the distance between microstructures increases, in such a way that for the microenvironment with 30 µm spacing, for example, just a few cells are observed. Thus, our results demonstrate that the produced microenvironments are applicable in deeper studies in microbiology, with potential application in tissue engineering.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20122013-151051 |
| Date | 25 November 2013 |
| Creators | Salas, Oriana Ines Avila |
| Contributors | Mendonça, Cleber Renato |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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