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Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/5532 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Rostirolla, Diana Carolina |
| Contributors | Santos, Diógenes Santiago |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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