Made available in DSpace on 2018-04-20T12:03:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000488663-Texto+Completo-0.pdf: 2662669 bytes, checksum: 73c86d6d555c94d57c1f0714b5c2ccbc (MD5) Previous issue date: 2018 / Tuberculosis (TB), caused mainly by Mycobacterium tuberculosis, is an infectious disease responsible for a significant number of deaths worldwide. IQG-607 is an analog of isoniazid (INH). According to several experiments carried out by our research group, IQG-607 showed both in vitro and in vivo anti-TB activity. Initial studies showed that the compound INCT-TB551 (a quinoline derivative) also presents in vitro anti-TB activity. The aim of this study was to develop analytical methods by high performance liquid chromatography (HPLC-UV) for quantification of IQG-607 and INCT-TB551 in mice plasma, and therefore to perform pharmacokinetic studies. The analytical method for the determination of IQG-607 in mice plasma showed linearity (r = 0.9992) in 0.5– 50 μg/mL concentration range. Intra- and inter-day precision was < 15%, and the recovery ranged from 92.07 to 107.68%, showing that the method provides a precise and accurate analysis of the compound. In addition, IQG-607 was stable in plasma for at least 30 days at −80 °C, and after plasma processing, for 4 h in the auto-sampler (6 ºC) and maintained on ice (recovery > 85%). The applicability of the method for pharmacokinetic studies was determined after intravenous (i.v.) and oral (fasted and fed conditions) administrations to mice. IQG-607 levels in plasma were quantified at time points for up to 2.5 h. A short half-life (t1/2) (1.14 h), a high clearance (CL) (3.89 L/h/kg), a moderate volume of distribution at steady state (Vdss, 1.22 L/kg), were observed after i.v. (50 mg/kg) administration. Similar results were obtained for oral administration (250 mg/kg) under fasted and fed conditions. The oral bioavailability (F), approximately 4%, was not altered by feeding.Plasma protein binding was 88.87 ± 0.9%. Recently, experiments in mice infected with M. tuberculosis have shown that the compound INCT-TB551 has no in vivo activity, unlike previous in vitro activity studies. An analytical method was developed for the determination of INCT-TB551 in mice plasma to assess compound absorption, if any, after oral administration. The analytical method presented linearity from 0.1-10 μg/mL (r = 0.9999). After development of the analytical method, the compound was orally administered in mice and the plasma levels were quantified at time points for up to 1 h. The compound INCT-TB551 was detected in the plasma of animals, which indicated that INCT-TB551 was absorbed. Although absorbed when orally administered, the compound is not exhibiting activity against M. tuberculosis in this animal model. This finding may be associated with the formation of inactive metabolites and/or the plasma concentration of INCT-TB551 achieved may be inadequate to exert its therapeutic effect. However, these points require further investigations. The protocols described here may serve as support to initiate pharmacokinetic studies of promising compounds, collaborating to advance in earlier stages of drug development. / A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, responsável por um número considerável de mortes em todo o mundo. O composto IQG-607 é um análogo da isoniazida (INH) que, de acordo com diversos experimentos realizados pelo grupo de pesquisa envolvido no seu estudo, apresenta atividade anti-TB in vitro e in vivo. Estudos iniciais do mesmo grupo demonstraram que o composto INCT-TB551 (um derivado quinolínico) também apresenta promissora atividade anti-TB. O objetivo deste estudo foi desenvolver metodologias analíticas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV) para a quantificação do composto IQG-607 e do INCT-TB551, em plasma de camundongos, para a realização de estudos de farmacocinética. O método analítico para a determinação do composto IQG-607 em plasma de camundongos apresentou linearidade (r = 0.9992) na faixa de 0.5–50 μg/mL. Os valores de precisão intra e interensaio (CV < 15%) e de recuperação (92.07-107.68%) demonstram que o método é preciso e exato para a análise do composto. Além disso, o IQG-607 se mostrou estável no plasma por até 30 dias, quando armazenado no freezer -80 °C, e estável após o tratamento da amostra do plasma, por até 4 horas (h) na bancada (gelo) e no autosampler do equipamento (6 °C). A aplicabilidade do método analítico para o estudo de farmacocinética foi determinada após a administração i.v. e oral em camundongos (animais em jejum e animais alimentados). As concentrações plasmáticas de IQG-607 foram quantificadas por até 2,5 h após a administração nos animais.Quando administrado pela via i.v. foi observado um tempo de meia vida (t1/2) curto (1,14 h), elevado clearance (CL) (3,89 L/h/kg), e um moderado volume de distribuição (Vdss) (1,22 L/kg). Resultados similares foram obtidos após a administração oral (250 mg/kg) em camundongos que estavam em jejum ou alimentados. A biodisponibilidade oral (F) foi de aproximadamente 4 %, valor que não foi alterado pela alimentação. A taxa de ligação a proteínas plasmáticas do IQG-607 é de aproximadamente 88 ± 0.9%. Experimentos recentes em camundongos infectados com M. tuberculosis demonstraram que o composto INCT-TB551 não apresentou atividade neste modelo in vivo, ao contrário dos estudos de atividade in vitro realizados anteriormente. Um método analítico para a determinação do composto INCT-TB551 em plasma de camundongos foi desenvolvido para avaliar se o composto estava sendo absorvido após a administração oral. O método analítico apresentou linearidade na faixa de 0.1-10 μg/mL (r = 0.9999). Após o método ter sido padronizado, o composto foi administrado por via oral em camundongos, e as concentrações plasmáticas foram quantificadas por até 1 h após a administração. O composto INCT-TB551 foi detectado no plasma dos animais, indicando que estava sendo absorvido. Apesar de absorvido quando administrado por via oral, o composto não está apresentando atividade contra M. tuberculosis neste modelo animal, o que pode estar relacionado, por exemplo, com a formação de metabólitos inativos e/ou ainda, o nível plasmático atingido pode ser inadequado para que o composto consiga exercer o seu efeito terapêutico, e isto precisa ser melhor investigado. Os protocolos apresentados neste trabalho poderão servir como suporte para estudos de farmacocinéticoa de compostos que se apresentam promissores, colaborando para o avanço nas etapas necessárias para o desenvolvimento de possíveis fármacos.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451791-Texto+Completo-0.pdf: 11131527 bytes, checksum: 73b1d535d96f83c30dd5fb46e7f2af5d (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434470-Texto+Completo-0.pdf: 6587349 bytes, checksum: 405b1e4ec3fc9ec1beb9e4856acacdf7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Approximately one-third of the world’s population is infected with Mycobacterium tuberculosis, the aetiological agent of human tuberculosis (TB). As global incidence of drug-resistance constantly increases, the urgent need for developing new anti-TB drugs and vaccines becomes more evident. Component enzymes of fundamental metabolic pathways seem to be attractive as define molecular targets. Guanosine monophosphate synthase (GMPS), a G-type amidotransferase, catalyzes the amination of xanthosine monophosphate (XMP) to guanosine monophosphate (GMP) in a reaction that occurs in two domains, the glutamine amidotransferase and the ATP pyrophosphatase, where it attacks a highly reactive adenyl-XMP intermediate, leading to GMP formation. The guaA (Rv3396c) gene, which codes for GMPS, was identified by sequence homology in the M. tuberculosis H37Rv genome. We evidenced that adenyl-XMP formation causes enzyme inhibition by increase of ATP and XMP levels. In addition, M. tuberculosis GMPS (MtGMPS) displays an allosteric behavior to XMP variation, demonstrating positive cooperativity and different kinetic aspects from that reported for human and Escherichia coli enzymes. The proposed ordered mechanism of substrates binding, which results in the release of pyrophosphate before binding ammonia showed to be the same to other GMPSs. Our results on MtGMPS might be useful to reveal its role in M. tuberculosis purine metabolism, providing knowledge for the development of new drugs and vaccines to treat and prevent TB, respectively. / Aproximadamente 1/3 da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana (TB). A incidência global e o constante aumento da resistência às drogas tornam evidente a urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas, para o tratamento, e vacinas, para a prevenção desta doença. As enzimas das vias metabólicas fundamentais são vistas como atrativos alvos moleculares definidos. A enzima guanosina monofosfato sintase (GMPS), uma amidotransferase do tipo G, catalisa a aminação da xantosina monofosfato (XMP) à guanosina monofosfato (GMP), em uma reação que ocorre em dois domínios, o glutamina amidotrasferase e o adenosina trifosfato (ATP) pirofosfatase, onde ocorre o ataque do intermediário altamente reativo adenil-XMP, levando a formação de GMP. O gene guaA (Rv3396c), o qual codifica a enzima GMPS, foi identificado por homologia de sequência no genoma de M. tuberculosis H37Rv. Nós evidenciamos que a formação do adenil-XMP causa uma inibição da enzima pelo aumento dos níveis de ATP e XMP. Além disso, a GMPS de M. tuberculosis (MtGMPS), apresentou um comportamento alostérico na variação dos níveis de XMP, demonstrando cooperatividade positiva e diferentes aspectos cinéticos dos já reportados para as enzimas de humanos e Escherichia coli. O mecanismo ping-pong foi proposto com base nos resultados evidenciados pela liberação de pirofosfato (PPi) depois da ligação da amônia, corroborando com os dados previamente publicados para outras GMPSs. Nossos resultados podem ser úteis por revelar o papel desta enzima no metabolismo de purinas do M. tuberculosis, fornecendo conhecimento para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para o tratamento e prevenção, respectivamente.

Made available in DSpace on 2013-12-03T01:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000452675-Texto+Completo-0.pdf: 2946901 bytes, checksum: 590f01e37b62ebd8cf1981d8100e6dfc (MD5) Previous issue date: 2013 / Since its discovery, Isoniazid remains the main drug used to treat tuberculosis, which has the 2-trans-enoyl-ACP(CoA) reductase or InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis as pharmacological target. However, the increase in cases of tuberculosis resistant to Isoniazid motivated the pharmaceutical industry and research groups to investigate possible inhibitors to InhA, whether seeking for new compounds that display the inhibitory function, or as proposed in this work, modifying existing compounds. Thus, we believe that the IQG607 inorganic compound, also known as pentacyano( Isoniazid)ferrate (II) - developed in an attempt to find new, more potent and selective inhibitors of the InhA enzyme - is a promising candidate for the development of new anti-tuberculosis drugs. This work began with a literature review in order to understand the role of InhA enzyme in the process of fatty acid synthesis and what they represent in the process of formation of the cell envelope of mycobacteria. In addition, a survey was conducted regarding the published studies on the IQG607, which reported efforts engaged in researching and obtaining the compound. Based on these studies, it was proposed the design of new compounds by introducing structural modifications in the IQG607 molecule, with the aid of specific software. Intermolecular interactions of these compounds with the target protein were simulated and evaluated with the use of AutoDock and LigPlot. Twenty-seven models were designed, and for all of them, simulations were performed in silico. Three of these compounds were selected, and from those one was successfully synthesized. After synthesis, enzymatic assays were carried out to assess whether the new compound had demonstrated inhibitory function as found in the original IQG607. Unfortunately, although the in silico simulations have led us to believe that the models designed could generate good compounds, early in the in vitro experiments we found that there was no variation in the enzyme’s activity, indicating that the compound showed no inhibitor effect. In our attempt to lengthen the IQG607 compound - thus allowing a greater number of torsion angles for the molecule, and thereby promote a better fit of the ligand binding cavity in the substrate - we discovered that two important pieces of INH were separated, which caused the loss of activity of the compound. It appears that the changes which were introduced in the IQG607 compound have hindered the acyl radical formation and therefore the adduct ligand-NADH could not be formed. / Desde a sua descoberta, a Isoniazida continua sendo o principal fármaco empregado no tratamento da tuberculose, tendo como alvo farmacológico a enzima 2-trans-enoil- ACP(CoA) redutase ou InhA de Mycobacterium tuberculosis. Porém, o aumento dos casos de tuberculose resistente à Isoniazida motivaram a indústria farmacêutica e pesquisadores a investigar possíveis inibidores da InhA, seja buscando novos compostos que apresentem a característica inibitória, ou como na proposta deste trabalho, modificando compostos já existentes. Desta forma, acreditamos que o composto inorgânico IQG607, também conhecido como pentaciano(isoniazida)ferrato (II), desenvolvido na tentativa de encontrar novos inibidores mais potentes e seletivos para a enzima InhA, é um candidato promissor ao desenvolvimento de novas drogas anti-tuberculose. Este trabalho iniciou com uma pesquisa na literatura científica buscando compreender o papel da enzima InhA no processo de síntese de ácidos graxos e o que estes representam no processo de formação do envelope celular das micobactérias. Além disso, foi realizado um levantamento a respeito dos estudos já publicados sobre o IQG607, que relatam os esforços empenhados na pesquisa e obtenção do composto. Com base nestes estudos, foi proposto o desenho de novos compostos introduzindo modificações estruturais na molécula do IQG607 original, com o auxilio de software específico. As interações intermoleculares desses compostos com a proteína alvo foram simuladas e avaliadas, com o uso dos programas AutoDock e LigPlot. Vinte e sete modelos foram desenhados, e para todos eles foram realizadas as simulações in silico. Três desses compostos foram selecionados e, deles, um foi sintetizado com sucesso. Após a síntese, ensaios enzimáticos avaliaram se o novo composto mantinha a função inibitória comprovadamente encontrada no IQG607 original, caracterizando a etapa in vitro deste trabalho. Infelizmente, embora as simulações in silico tenham nos levado a crer que os modelos desenhados poderiam gerar bons compostos, já no início da etapa in vitro se descobriu que não havia variação na atividade da enzima, o que indica que o composto não apresentou o efeito inibitório esperado. Em nossa tentativa de alongar o composto IQG607, permitindo assim um número maior de ângulos de torção para a molécula, e com isso, promover um melhor encaixe do ligante na cavidade de ligação do substrato, descobrimos que dois grupamentos importantes da INH foram separados, o que provocou a perda de atividade do fármaco. Supõe-se que as modificações introduzidas no composto IQG607 impediram a formação do radical acil e, portanto, o aduto com o NADH não pôde ser formado.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 434470.pdf: 6587349 bytes, checksum: 405b1e4ec3fc9ec1beb9e4856acacdf7 (MD5) Previous issue date: 2011-08-24 / Aproximadamente 1/3 da popula??o mundial est? infectada com o Mycobacterium tuberculosis, agente etiol?gico da tuberculose humana (TB). A incid?ncia global e o constante aumento da resist?ncia ?s drogas tornam evidente a urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas, para o tratamento, e vacinas, para a preven??o desta doen?a. As enzimas das vias metab?licas fundamentais s?o vistas como atrativos alvos moleculares definidos. A enzima guanosina monofosfato sintase (GMPS), uma amidotransferase do tipo G, catalisa a amina??o da xantosina monofosfato (XMP) ? guanosina monofosfato (GMP), em uma rea??o que ocorre em dois dom?nios, o glutamina amidotrasferase e o adenosina trifosfato (ATP) pirofosfatase, onde ocorre o ataque do intermedi?rio altamente reativo adenil-XMP, levando a forma??o de GMP. O gene guaA (Rv3396c), o qual codifica a enzima GMPS, foi identificado por homologia de sequ?ncia no genoma de M. tuberculosis H37Rv. N?s evidenciamos que a forma??o do adenil-XMP causa uma inibi??o da enzima pelo aumento dos n?veis de ATP e XMP. Al?m disso, a GMPS de M. tuberculosis (MtGMPS), apresentou um comportamento alost?rico na varia??o dos n?veis de XMP, demonstrando cooperatividade positiva e diferentes aspectos cin?ticos dos j? reportados para as enzimas de humanos e Escherichia coli. O mecanismo ping-pong foi proposto com base nos resultados evidenciados pela libera??o de pirofosfato (PPi) depois da liga??o da am?nia, corroborando com os dados previamente publicados para outras GMPSs. Nossos resultados podem ser ?teis por revelar o papel desta enzima no metabolismo de purinas do M. tuberculosis, fornecendo conhecimento para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para o tratamento e preven??o, respectivamente

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451791.pdf: 11131527 bytes, checksum: 73b1d535d96f83c30dd5fb46e7f2af5d (MD5) Previous issue date: 2013-09-11 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1.1.1.205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5 -monophosphate (IMP) to xanthosine 5 - monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7.5 and 9.0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doen?as infectocontagiosas e estima-se que um ter?o da popula??o mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos dispon?veis h? mais de 50 anos, a TB ? respons?vel por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfec??o com o HIV e a emerg?ncia de TB resistente a m?ltiplas drogas representam um desafio ? sa?de p?blica e t?m estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terap?uticos contra a doen?a. Avan?os na identifica??o de novos alvos para drogas contra a TB t?m sido poss?veis gra?as ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucida??o da fun??o de prote?nas envolvidas em rotas bioqu?micas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1.1.1.205) ? uma enzima chave na bioss?ntese de nucleot?deos de purina, pois participa de uma etapa limitante na s?ntese de novo de nucleot?deos de guanina, a partir de inosina 5 -monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxida??o de IMP a xantosina 5 -monofosfato (XMP), com concomitante convers?o de nicotinamida adenina dinucleot?deo (NAD+) ? sua forma reduzida, NADH. Essa rea??o controla os n?veis de nucleot?deos de guanina e inibidores da IMPDH t?m sido utilizados como agentes imunossupressores, antic?ncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima t?m sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da regi?o codificante do gene guaB2, a express?o e a purifica??o da prote?na MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular m?dia de 54.775 Da e a an?lise atrav?s de Espectroscopia de Absor??o At?mica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emiss?o ?ptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um ?on K+ por subunidade. Os experimentos de rea??o cruzada, utilizando glutaralde?do, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetr?mero em solu??o. Os estudos de cin?tica em estado estacion?rio revelaram que a atividade catal?tica da MtIMPDH ? dependente de c?tions monovalentes, principalmente K+. Os estudos de velocidade inicial e inibi??o pelos produtos sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo cin?tico sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente ? MtIMPDH, seguido pela liga??o do NAD+, e que a transfer?ncia do hidreto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela enzima em estudo. Al?m disso, a inibi??o pelo substrato NAD+ indica que a libera??o dos produtos ? ordenada, onde o NADH ? o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotona??o de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 ? essencial para a atividade catal?tica da MtIMPDH e, que amino?cidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK pr?ximos de 7,5 e 9,0 est?o envolvidos na liga??o ao NAD+. Os dados aqui apresentados s?o discutidos com base em estudos cin?ticos e estruturais dispon?veis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Al?m disso, a identifica??o de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutag?nese s?tio-dirigida por substitui??o g?nica, a fim de avaliar a import?ncia do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene ? essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirma??o da essencialidade permitir? a valida??o do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracteriza??o cin?tica da enzima e da substitui??o g?nica representaram o ponto de partida para o planejamento, sele??o e testes de poss?veis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos qu?micos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibi??o n?o-competitivo e incompetitivo em rela??o aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracteriza??o da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibi??o desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas objetivando o controle da TB.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-08-03T18:19:52Z No. of bitstreams: 1 DIS_GUSTAVO_BELLANI_MIGOTT_COMPLETO.pdf: 6201853 bytes, checksum: 70237f84b98539735536877e1ffbc4e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T18:19:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_GUSTAVO_BELLANI_MIGOTT_COMPLETO.pdf: 6201853 bytes, checksum: 70237f84b98539735536877e1ffbc4e7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Tuberculosis is an infectious disease responsible for about 1.3 million deaths annually worldwide. Despite the appearance of multi-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), since the 80?s there is a gap in the development of new antimicrobials. With the advent of bioinformatics and computational molecular biophysics, became possible to test, from a established molecular target, numerous molecules, especially associated with the prediction of binding free energy. In the current dissertation, were selected 14 compounds with recognized activity against the enzyme 2-trans-enoil-ACP redutase (InhA, EC 1.3.1.9) of Mtb. These molecules were divided into three groups. Set 1: 5 compounds with distant values of binding free energy. Set 2: 9 compounds with close binding free energy values and similar molecular structures (derived from Genz 10850). Set 3: 14 ligands, corresponding to the sum of the set?s 1 and 2. Sampling obtained from molecular dynamics and 2 ns of simulations, in explicit solvent, allowed to estimate the free energy of bind associated with the methods MM/GBSA, MM/PBSA, (QM)MM/GBSA, LigScore, DrugScore, AutoDock and SQM. The ranking of the compounds were based in the correlation (R2) between the predicted and experimental values. Results showed similar values of R2 in all tested methods. More accurate methods, such as SQM and (QM)/MM/GBSA, not obtained better correlations in comparison with simplified methods, as LigScore and DrugScore. In general, Set 1 obtained a moderate correlation (R2 of 0.00-0.80). Set?s 2 and 3, showed weak correlation (R2 < 0.40). Despite the satisfactory results of Set 1, the tested methods presented limitations in the ranking of compounds with close values of experimental binding free energy and similar molecular structures, as Set 2. / A tuberculose ? uma doen?a infectocontagiosa respons?vel por cerca de 1,3 milh?o de mortes anualmente a n?vel mundial. Apesar do aparecimento de cepas multirresistentes de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), desde a d?cada de 80 se observa uma lacuna no desenvolvimento de novos antimicrobianos. Com o advento da bioinform?tica e biof?sica molecular computacional, tornou-se poss?vel, a partir de um alvo molecular preestabelecido, testar in?meros candidatos a f?rmacos, com destaque para a predi??o da energia livre de liga??o. Nesta disserta??o, foram selecionados 14 compostos com conhecida atividade frente a enzima 2-trans-enoil-ACP redutase (InhA, EC 1.3.1.9) de Mtb. Estas mol?culas foram divididas em 3 grupos. Grupo 1: 5 compostos com valores esparsos de energia livre. Grupo 2: 9 compostos com valores similares de energia livre e derivadas do composto Genz-10850. Grupo 3: 14 compostos correspondendo ? uni?o dos Grupos 1 e 2. Amostragens por simula??es de din?mica molecular de 2 ns, em solvente expl?cito, permitiram estimar os valores da energia livre de liga??o destes compostos com os m?todos MM/GBSA, MM/PBSA, (QM)MM/GBSA, LigScore, DrugScore, AutoDock e SQM. O ranqueamento dos compostos foi baseado na correla??o (R2) entre valores experimentais e estimados de energia livre. Os resultados apontaram valores de R2 similares entre os m?todos testados. T?cnicas mais robustas, como SQM e (QM)MM/GBSA, n?o obtiveram resultados mais acurados em compara??o ?quelas mais simples, como LigScore e DrugScore. No geral, foram obtidos valores moderados de correla??o (R2 de 0,00-0,80) para o Grupo 1. Os Grupos 2 e 3 exibiram correla??es fracas (R2 <0,40). Apesar dos resultados satisfat?rios para o Grupo 1, os m?todos utilizados apresentaram limita??es e n?o foram capazes de predizer e ranquear corretamente compostos com valores pr?ximos de energia livre e estruturas moleculares similares, como os do Grupo 2.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 452675.pdf: 2946901 bytes, checksum: 590f01e37b62ebd8cf1981d8100e6dfc (MD5) Previous issue date: 2013-08-15 / Since its discovery, Isoniazid remains the main drug used to treat tuberculosis, which has the 2-trans-enoyl-ACP(CoA) reductase or InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis as pharmacological target. However, the increase in cases of tuberculosis resistant to Isoniazid motivated the pharmaceutical industry and research groups to investigate possible inhibitors to InhA, whether seeking for new compounds that display the inhibitory function, or as proposed in this work, modifying existing compounds. Thus, we believe that the IQG607 inorganic compound, also known as pentacyano(Isoniazid)ferrate (II) - developed in an attempt to find new, more potent and selective inhibitors of the InhA enzyme - is a promising candidate for the development of new anti-tuberculosis drugs. This work began with a literature review in order to understand the role of InhA enzyme in the process of fatty acid synthesis and what they represent in the process of formation of the cell envelope of mycobacteria. In addition, a survey was conducted regarding the published studies on the IQG607, which reported efforts engaged in researching and obtaining the compound. Based on these studies, it was proposed the design of new compounds by introducing structural modifications in the IQG607 molecule, with the aid of specific software. Intermolecular interactions of these compounds with the target protein were simulated and evaluated with the use of AutoDock and LigPlot. Twenty-seven models were designed, and for all of them, simulations were performed in silico. Three of these compounds were selected, and from those one was successfully synthesized. After synthesis, enzymatic assays were carried out to assess whether the new compound haddemonstrated inhibitory function as found in the original IQG607. Unfortunately, although the in silico simulations have led us to believe that the models designed could generate good compounds, early in the in vitro experiments we found that there was no variation in the enzyme s activity, indicating that the compound showed no inhibitor effect. In our attempt to lengthen the IQG607 compound - thus allowing a greater number of torsion angles for the molecule, and thereby promote a better fit of the ligand binding cavity in the substrate - we discovered that two important pieces of INH were separated, which caused the loss of activity of the compound. It appears that the changes which were introduced in the IQG607 compound have hindered the acyl radical formation and therefore the adduct ligand-NADH could not be formed. / Desde a sua descoberta, a Isoniazida continua sendo o principal f?rmaco empregado no tratamento da tuberculose, tendo como alvo farmacol?gico a enzima 2-trans-enoil- ACP(CoA) redutase ou InhA de Mycobacterium tuberculosis. Por?m, o aumento dos casos de tuberculose resistente ? Isoniazida motivaram a ind?stria farmac?utica e pesquisadores a investigar poss?veis inibidores da InhA, seja buscando novos compostos que apresentem a caracter?stica inibit?ria, ou como na proposta deste trabalho, modificando compostos j? existentes. Desta forma, acreditamos que o composto inorg?nico IQG607, tamb?m conhecido como pentaciano(isoniazida)ferrato (II), desenvolvido na tentativa de encontrar novos inibidores mais potentes e seletivos para a enzima InhA, ? um candidato promissor ao desenvolvimento de novas drogas anti-tuberculose. Este trabalho iniciou com uma pesquisa na literatura cient?fica buscando compreender o papel da enzima InhA no processo de s?ntese de ?cidos graxos e o que estes representam no processo de forma??o do envelope celular das micobact?rias. Al?m disso, foi realizado um levantamento a respeito dos estudos j? publicados sobre o IQG607, que relatam os esfor?os empenhados na pesquisa e obten??o do composto. Com base nestes estudos, foi proposto o desenho de novos compostos introduzindo modifica??es estruturais na mol?cula do IQG607 original, com o auxilio de software espec?fico. As intera??es intermoleculares desses compostos com a prote?na alvo foram simuladas e avaliadas, com o uso dos programas AutoDock e LigPlot. Vinte e sete modelos foram desenhados, e para todos eles foram realizadas as simula??es in silico. Tr?s desses compostos foram selecionados e, deles, um foi sintetizado com sucesso. Ap?s a s?ntese, ensaios enzim?ticos avaliaram se o novo composto mantinha a fun??o inibit?ria comprovadamente encontrada no IQG607 original, caracterizando a etapa in vitro deste trabalho. Infelizmente, embora as simula??es in silico tenham nos levado a crer que os modelos desenhados poderiam gerar bons compostos, j? no in?cio da etapa in vitro se descobriu que n?o havia varia??o na atividade da enzima, o que indica que o composto n?o apresentou o efeito inibit?rio esperado. Em nossa tentativa de alongar o composto IQG607, permitindo assim um n?mero maior de ?ngulos de tor??o para a mol?cula, e com isso, promover um melhor encaixe do ligante na cavidade de liga??o do substrato, descobrimos que dois grupamentos importantes da INH foram separados, o que provocou a perda de atividade do f?rmaco. Sup?e-se que as modifica??es introduzidas no composto IQG607 impediram a forma??o do radical acil e, portanto, o aduto com o NADH n?o p?de ser formado.

Made available in DSpace on 2015-09-30T02:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475295-Texto+Parcial-0.pdf: 563 bytes, checksum: 4a169fcc2d293d6f288381480124104f (MD5) Previous issue date: 2015 / The species of the “C. parapsilosis complex” are common etiological agents of nosocomial candidemia, and C. parapsilosis sensu stricto is one of non-albicans Candida species with the highest incidences in clinical infections, primarily related to implanted medical devices. In this study, we identified 29 isolates comprising the “C. parapsilosis complex” to species level, all previously obtained from the hospital environment and medical tools. The isolates were also characterized for in vitro activity of aspartyl proteinase and phospholipase, as well as for their ability to form biofilms. The isolates identified as C. parapsilosis sensu stricto were also evaluated for their capability to interact with Staphylococcus aureus and Acinetobacter sp. in two-species polymicrobial biofilms. These biofilms were then analyzed for their tolerance to treatments with increasing concentrations of antimicrobials drugs and sanitizers. The results indicated that 75. 9% of the isolates were identified as C. parapsilosis sensu stricto, 24. 1% as Candida metapsilosis and none as Candida orthopsilosis. Regarding C. parapsilosis sensu stricto, all isolates were very strong producers of aspartyl proteinase, and 13. 6% of phospholipase. Regarding C. metapsilosis, 71. 4% and 14. 3% of the isolates showed very strong aspartyl proteinase and phospholipase activity, respectively. Moreover, all isolates were able to form biofilm on polystyrene surface. Among the C. parapsilosis sensu stricto isolates, 9. 1%, 45. 4% and 45. 4% were strong, moderate and weak biofilm producers, respectively. Regarding C. metapsilosis, 71. 4% were moderate and 28. 6% were weak biofilm producers. We also demonstrated that C. parapsilosis sensu stricto was capable of associating synergistically with both bacteria tested, since in polymicrobial biofilms a significantly higher number of bacterial cells adhered, compared to their own monomicrobial condition. However, bacterial cells did not interfere on the efficiency of yeast biofilm formation. When testing sanitizers, we showed that 70% ethyl alcohol and 1% sodium hypochlorite were effective to significantly decrease the number of viable cells, although they have not been able to eliminate the microbial populations of the biofilms. Our data also showed that the cells from all monomicrobial biofilms exhibited elevated tolerance to their respective antimicrobial drugs, at higher doses than their pre-determined minimal inhibitory concentration values. Nevertheless, biofilms of 6, 12 and 24 h of C. parapsilosis sensu stricto presented some decrease in cell viability to the treatment with ketoconazole, whereas 48 h biofilms were resistant to this antifungal. In polymicrobial biofilms, the bacterial cells did not affect the tolerance of yeast isolates to this antimicrobial. Conversely, S. aureus and Acinetobacter sp. cells were even more tolerant to the treatment with vancomycin and polymyxin B, respectively, when they were in polymicrobial biofilms, which was significantly different from their respective monomicrobial condition. The results from this work revealed the ability of “C. parapsilosis complex” isolates from nosocomial environment to express important virulence factors, as well as to interact synergistically with bacterial species of clinical importance. This data is clinically relevant, since such phenotypic features may represent an important risk in terms of nosocomial infection to hospitalized patients. / As espécies do “complexo Candida parapsilosis” mostram-se como frequentes agentes etiológicos de candidemias nosocomiais, sendo a C. parapsilosis sensu stricto uma das espécies não-albicans de Candida de maior incidência em infecções clínicas, estando relacionada principalmente com dispositivos médicos implantados. Neste estudo, identificamos, em nível de espécie, 29 isolados pertencentes ao “complexo Candida parapsilosis”, todos previamente obtidos a partir do ambiente hospitalar e de dispositivos médicos. Os isolados também foram caracterizados quanto à atividade in vitro de aspartil proteinase e fosfolipase, e quanto à habilidade de formar biofilmes. Os isolados identificados como C. parapsilosis sensu stricto foram avaliados quanto à capacidade de interagir com Staphylococcus aureus e Acinetobacter sp. no desenvolvimento de biofilmes polimicrobianos de duas espécies. Estes biofilmes foram então analisados quanto à sua capacidade de tolerar o tratamento com concentrações crescentes de fármacos antimicrobianos e sanitizantes. Como resultados, 75,9% dos isolados foram identificados como C. parapsilosis sensu stricto, 24,1% como Candida metapsilosis e nenhum como Candida orthopsilosis. Em relação à C. parapsilosis sensu stricto, todos os isolados mostraram-se como produtores muito fortes de aspartil proteinase e 13,6% de fosfolipase. Em relação à C. metapsilosis, 71,4% e 14,3% dos isolados apresentaram atividade muito forte de aspartil proteinase e fosfolipase, respectivamente. Além disso, todos os isolados foram capazes de formar biofilme em superfície de poliestireno. Dentre os isolados de C. parapsilosis sensu stricto, 9,1%, 45,4% e 45,4% mostraram-se como produtores fortes, moderados e fracos de biofilme, respectivamente. Em relação aos de C. metapsilosis, 71,4% foram moderados e 28,6% foram fracos formadores de biofilme. Demonstramos também que a C. parapsilosis sensu stricto foi capaz de se associar de forma sinérgica com ambas as bactérias testadas, pois nos biofilmes polimicrobianos um número significativamente maior de células bacterianas se aderiram em comparação à sua condição monomicrobiana. Entretanto, as bactérias não interferiram na eficiência de formação de biofilmes da levedura. O tratamento com sanitizantes mostrou que o álcool etílico a 70% e o hipoclorito de sódio a 1% foram eficazes em diminuir significativamente o número de células viáveis, mas não foram capazes, mesmo assim, de eliminar as populações microbianas dos biofilmes. Além disso, nossos dados mostraram que as células integrantes de todos os biofilmes monomicrobianos avaliados apresentaram elevada tolerância aos seus respectivos antimicrobianos, em doses superiores aos seus valores de concentração inibitória mínima, previamente determinados. Mesmo assim, os biofilmes de C. parapsilosis sensu stricto de 6, 12 e 24 h mostraram alguma perda de viabilidade celular ao tratamento com cetoconazol, enquanto biofilmes de 48 h se mostraram resistentes a este antifúngico. Nos biofilmes polimicrobianos, a presença das células bacterianas não influenciou a tolerância das leveduras ao antimicrobiano. Por outro lado, as células de S. aureus e Acinetobacter sp. foram ainda mais tolerantes ao tratamento com vancomicina e polimixina B, respectivamente, quando em biofilmes polimicrobianos, de forma significativa em comparação às suas respectivas condições monomicrobianas. Os resultados deste trabalho revelaram a capacidade de isolados do “complexo C. parapsilosis” do ambiente nosocomial de expressar importantes fatores de virulência, bem como de interagir sinergicamente com bactérias de importância clínica. Em conjunto, estas informações mostram-se de grande relevância clínica, em função de tais características fenotípicas representarem um importante risco em termos de infecção hospitalar a pacientes internados.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-09-29T12:35:39Z No. of bitstreams: 1 475295 Texto Parcial.pdf: 664846 bytes, checksum: 9cb2bbfb96e686e96f2556c4ca6750c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-09-29T12:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 475295 Texto Parcial.pdf: 664846 bytes, checksum: 9cb2bbfb96e686e96f2556c4ca6750c4 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / The species of the ?C. parapsilosis complex? are common etiological agents of nosocomial candidemia, and C. parapsilosis sensu stricto is one of non-albicans Candida species with the highest incidences in clinical infections, primarily related to implanted medical devices. In this study, we identified 29 isolates comprising the ?C. parapsilosis complex? to species level, all previously obtained from the hospital environment and medical tools. The isolates were also characterized for in vitro activity of aspartyl proteinase and phospholipase, as well as for their ability to form biofilms. The isolates identified as C. parapsilosis sensu stricto were also evaluated for their capability to interact with Staphylococcus aureus and Acinetobacter sp. in two-species polymicrobial biofilms. These biofilms were then analyzed for their tolerance to treatments with increasing concentrations of antimicrobials drugs and sanitizers. The results indicated that 75.9% of the isolates were identified as C. parapsilosis sensu stricto, 24.1% as Candida metapsilosis and none as Candida orthopsilosis. Regarding C. parapsilosis sensu stricto, all isolates were very strong producers of aspartyl proteinase, and 13.6% of phospholipase. Regarding C. metapsilosis, 71.4% and 14.3% of the isolates showed very strong aspartyl proteinase and phospholipase activity, respectively. Moreover, all isolates were able to form biofilm on polystyrene surface. Among the C. parapsilosis sensu stricto isolates, 9.1%, 45.4% and 45.4% were strong, moderate and weak biofilm producers, respectively. Regarding C. metapsilosis, 71.4% were moderate and 28.6% were weak biofilm producers.We also demonstrated that C. parapsilosis sensu stricto was capable of associating synergistically with both bacteria tested, since in polymicrobial biofilms a significantly higher number of bacterial cells adhered, compared to their own monomicrobial condition. However, bacterial cells did not interfere on the efficiency of yeast biofilm formation. When testing sanitizers, we showed that 70% ethyl alcohol and 1% sodium hypochlorite were effective to significantly decrease the number of viable cells, although they have not been able to eliminate the microbial populations of the biofilms. Our data also showed that the cells from all monomicrobial biofilms exhibited elevated tolerance to their respective antimicrobial drugs, at higher doses than their pre-determined minimal inhibitory concentration values. Nevertheless, biofilms of 6, 12 and 24 h of C. parapsilosis sensu stricto presented some decrease in cell viability to the treatment with ketoconazole, whereas 48 h biofilms were resistant to this antifungal. In polymicrobial biofilms, the bacterial cells did not affect the tolerance of yeast isolates to this antimicrobial. Conversely, S. aureus and Acinetobacter sp. cells were even more tolerant to the treatment with vancomycin and polymyxin B, respectively, when they were in polymicrobial biofilms, which was significantly different from their respective monomicrobial condition.The results from this work revealed the ability of ?C. parapsilosis complex? isolates from nosocomial environment to express important virulence factors, as well as to interact synergistically with bacterial species of clinical importance. This data is clinically relevant, since such phenotypic features may represent an important risk in terms of nosocomial infection to hospitalized patients. / As esp?cies do ?complexo Candida parapsilosis? mostram-se como frequentes agentes etiol?gicos de candidemias nosocomiais, sendo a C. parapsilosis sensu stricto uma das esp?cies n?o-albicans de Candida de maior incid?ncia em infec??es cl?nicas, estando relacionada principalmente com dispositivos m?dicos implantados. Neste estudo, identificamos, em n?vel de esp?cie, 29 isolados pertencentes ao ?complexo Candida parapsilosis?, todos previamente obtidos a partir do ambiente hospitalar e de dispositivos m?dicos. Os isolados tamb?m foram caracterizados quanto ? atividade in vitro de aspartil proteinase e fosfolipase, e quanto ? habilidade de formar biofilmes. Os isolados identificados como C. parapsilosis sensu stricto foram avaliados quanto ? capacidade de interagir com Staphylococcus aureus e Acinetobacter sp. no desenvolvimento de biofilmes polimicrobianos de duas esp?cies. Estes biofilmes foram ent?o analisados quanto ? sua capacidade de tolerar o tratamento com concentra??es crescentes de f?rmacos antimicrobianos e sanitizantes. Como resultados, 75,9% dos isolados foram identificados como C. parapsilosis sensu stricto, 24,1% como Candida metapsilosis e nenhum como Candida orthopsilosis. Em rela??o ? C. parapsilosis sensu stricto, todos os isolados mostraram-se como produtores muito fortes de aspartil proteinase e 13,6% de fosfolipase. Em rela??o ? C. metapsilosis, 71,4% e 14,3% dos isolados apresentaram atividade muito forte de aspartil proteinase e fosfolipase, respectivamente.Al?m disso, todos os isolados foram capazes de formar biofilme em superf?cie de poliestireno. Dentre os isolados de C. parapsilosis sensu stricto, 9,1%, 45,4% e 45,4% mostraram-se como produtores fortes, moderados e fracos de biofilme, respectivamente. Em rela??o aos de C. metapsilosis, 71,4% foram moderados e 28,6% foram fracos formadores de biofilme. Demonstramos tamb?m que a C. parapsilosis sensu stricto foi capaz de se associar de forma sin?rgica com ambas as bact?rias testadas, pois nos biofilmes polimicrobianos um n?mero significativamente maior de c?lulas bacterianas se aderiram em compara??o ? sua condi??o monomicrobiana. Entretanto, as bact?rias n?o interferiram na efici?ncia de forma??o de biofilmes da levedura. O tratamento com sanitizantes mostrou que o ?lcool et?lico a 70% e o hipoclorito de s?dio a 1% foram eficazes em diminuir significativamente o n?mero de c?lulas vi?veis, mas n?o foram capazes, mesmo assim, de eliminar as popula??es microbianas dos biofilmes. Al?m disso, nossos dados mostraram que as c?lulas integrantes de todos os biofilmes monomicrobianos avaliados apresentaram elevada toler?ncia aos seus respectivos antimicrobianos, em doses superiores aos seus valores de concentra??o inibit?ria m?nima, previamente determinados.Mesmo assim, os biofilmes de C. parapsilosis sensu stricto de 6, 12 e 24 h mostraram alguma perda de viabilidade celular ao tratamento com cetoconazol, enquanto biofilmes de 48 h se mostraram resistentes a este antif?ngico. Nos biofilmes polimicrobianos, a presen?a das c?lulas bacterianas n?o influenciou a toler?ncia das leveduras ao antimicrobiano. Por outro lado, as c?lulas de S. aureus e Acinetobacter sp. foram ainda mais tolerantes ao tratamento com vancomicina e polimixina B, respectivamente, quando em biofilmes polimicrobianos, de forma significativa em compara??o ?s suas respectivas condi??es monomicrobianas. Os resultados deste trabalho revelaram a capacidade de isolados do ?complexo C. parapsilosis? do ambiente nosocomial de expressar importantes fatores de virul?ncia, bem como de interagir sinergicamente com bact?rias de import?ncia cl?nica. Em conjunto, estas informa??es mostram-se de grande relev?ncia cl?nica, em fun??o de tais caracter?sticas fenot?picas representarem um importante risco em termos de infec??o hospitalar a pacientes internados.