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Previous issue date: 2013-09-11 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1.1.1.205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5 -monophosphate (IMP) to xanthosine 5 - monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7.5 and 9.0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doen?as infectocontagiosas e estima-se que um ter?o da popula??o mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos dispon?veis h? mais de 50 anos, a TB ? respons?vel por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfec??o com o HIV e a emerg?ncia de TB resistente a m?ltiplas drogas representam um desafio ? sa?de p?blica e t?m estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terap?uticos contra a doen?a. Avan?os na identifica??o de novos alvos para drogas contra a TB t?m sido poss?veis gra?as ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucida??o da fun??o de prote?nas envolvidas em rotas bioqu?micas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1.1.1.205) ? uma enzima chave na bioss?ntese de nucleot?deos de purina, pois participa de uma etapa limitante na s?ntese de novo de nucleot?deos de guanina, a partir de inosina 5 -monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxida??o de IMP a xantosina 5 -monofosfato (XMP), com concomitante convers?o de nicotinamida adenina dinucleot?deo (NAD+) ? sua forma reduzida, NADH. Essa rea??o controla os n?veis de nucleot?deos de guanina e inibidores da IMPDH t?m sido utilizados como agentes imunossupressores, antic?ncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima t?m sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da regi?o codificante do gene guaB2, a express?o e a purifica??o da prote?na MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular m?dia de 54.775 Da e a an?lise atrav?s de Espectroscopia de Absor??o At?mica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emiss?o ?ptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um ?on K+ por subunidade. Os experimentos de rea??o cruzada, utilizando glutaralde?do, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetr?mero em solu??o. Os estudos de cin?tica em estado estacion?rio revelaram que a atividade catal?tica da MtIMPDH ? dependente de c?tions monovalentes, principalmente K+. Os estudos de velocidade inicial e inibi??o pelos produtos sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo cin?tico sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente ? MtIMPDH, seguido pela liga??o do NAD+, e que a transfer?ncia do hidreto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela enzima em estudo. Al?m disso, a inibi??o pelo substrato NAD+ indica que a libera??o dos produtos ? ordenada, onde o NADH ? o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotona??o de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 ? essencial para a atividade catal?tica da MtIMPDH e, que amino?cidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK pr?ximos de 7,5 e 9,0 est?o envolvidos na liga??o ao NAD+. Os dados aqui apresentados s?o discutidos com base em estudos cin?ticos e estruturais dispon?veis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Al?m disso, a identifica??o de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutag?nese s?tio-dirigida por substitui??o g?nica, a fim de avaliar a import?ncia do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene ? essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirma??o da essencialidade permitir? a valida??o do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracteriza??o cin?tica da enzima e da substitui??o g?nica representaram o ponto de partida para o planejamento, sele??o e testes de poss?veis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos qu?micos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibi??o n?o-competitivo e incompetitivo em rela??o aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracteriza??o da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibi??o desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas objetivando o controle da TB.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/1749 |
| Date | 11 September 2013 |
| Creators | Rostirolla, Diana Carolina |
| Contributors | Santos, Di?genes Santiago |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Medicina e Ci?ncias da Sa?de, PUCRS, BR, Faculdade de Medicina |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 7620745074616285884, 500, 600, -8624664729441623247 |
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