Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Anexos. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-26T16:10:44Z
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2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are insect viruses widely used in the biological control of agricultural pests and as a tool for heterologous protein expression. Their low production costs, security in manipulation and the many ways of protein expression, make baculoviruses and insect cells an effective choice for the efficient expression of vaccine antigens and VLPs (Virus like particles) production. In chapter 1 of this work, it was evaluated the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing EDIII (Yellow fever virus -YF- envelope protein domain III) fused to the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) GP64 protein; and also of a protein mass generated by the fusion of the EDIII and AcMNPV polyhedrin protein. The EDIII interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. We showed in this work the confirmation of the correct recombinant protein expression (GP64 + EDIII and Polyhedrin + EDIII) by Western blot, optical and confocal microscopy. In the case of the EDIII fused with AcMNPV and AgMNPV GP64, the recombinant viral particles were purified and inoculated in mice. The lymphocyte proliferation assay showed a higher proliferation in mice immunized with recombinant virus containing the EDIII fused with the GP64 from the AgMNPV baculovirus comparing to the LPS control. Complementary assays will be carried out in order to evaluate the immunological response pattern and to confirm the production of a vaccine antigen against YF. In chapter 2, the baculovirus expression system was used to express the GAG protein precursor (Pr55) of HIV-1. The Pr55 expression is sufficient to VLP assembly on the cell host plasma membrane. However, the GP64 baculovirus protein is highly immunogenic and is also expressed on the surface of infected cells and is also present on the surface of the VLP. In this work, we showed that is not possible to separate BVs and VLPs produced in the same baculovirus infection cycle using different separation methodologies. Then, using a system able to produce GP64 free recombinant baculovirus, the recombinant virus vGAGHIV-1 GP64 null was produced and used to infect Sf9 cells. By Western blot analyses, it was shown that the baculovirus protein GP64 signal was missing in the recombinant virus infected cell extract. These same cells were observed by transmission electron microscopy (MET), showing that even when the GP64 is absent (which results in the absence of BVs production), VLPs budding continues to happen. This technique was shown to be efficient for VLPs production, free of baculvirus particles or proteins. This work confirms the efficiency of the baculovirus expression system for protein expression and VLPs of pharmacological interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/21421 |
| Date | 15 June 2016 |
| Creators | Chaves, Lorena Carvalho de Souza |
| Contributors | Blissard, Gary W., Ribeiro, Bergmann Morais |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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