Das Feline Coronavirus (FCoV) ist in den Katzenpopulationen der ganzen Welt weit verbreitet. Das Problem dieses Virus ist seine große Wahrscheinlichkeit zu mutieren. Einige dieser Mutationen können zu einer veränderten Pathogenität und zu einem schweren Verlauf der Infektion führen. So bleibt es möglicherweise nicht wie bei den meisten der infizierten Tiere bei einem inapparenten Verlauf oder milden Durchfall, sondern es kommt zur Entwicklung einer häufig tödlich endenden systemischen Erkrankung, der Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP). Um dies zu verhindern ist es essentiell, Virusausscheider schnell zu identifizieren und zu eliminieren, um den Virusdruck in Katzenpopulationen so gering wie möglich zu halten. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für den Nachweis von FCoV in Kot ist der Goldstandard, aber ist zeitaufwendig und erfordert ein gut ausgestattetes Labor. Als isothermale Methode liefert die Reverse Transkription Rekombinase Polymerase Amplifikation (RT-RPA) eine schnelle und kostengünstige Alternative für den molekularen Nachweis von FCoV.
Ziel dieser Studie war es, einen Schnelltest zum Nachweis von FCoV zu entwickeln, der auf der RT-RPA basiert.
Drei Vorwärts- und drei Rückwärtsprimer sowie eine Sonde wurden erstellt. Als Zielsequenz wurde die hochkonservierte, nicht-translatierte Region des 7b Gens gewählt. Alle möglichen Kombinationen dieser Primer wurden getestet und das Paar mit der höchsten Sensitivität für die weitere Validierung ausgewählt. Bei einer konstanten Temperatur von 42 °C wurde die reverse Transkription mit anschließender DNA-Amplifikation und Detektion innerhalb von 15 Minuten durchgeführt. Die analytische Sensitivität wurde anhand von neun Wiederholungen mit der Verdünnungsreihe des molekularen Standards (10^3-10^0RNA Kopien/µL) ermittelt und die Nachweisgrenze mittels Probit-Analyse berechnet. Für die Untersuchung auf Kreuzreaktionen wurde DNA oder RNA von 19 Viren getestet. Die Leistung der RT-RPA unter Verwendung klinischer Proben wurde mit extrahierter RNA von 39 felinen Kotproben analysiert. Alle Ergebnisse wurden denen der real-time RT-PCR gegenübergestellt. Die UTR des 7b Gens ausgewählter Proben, einschließlich einer falsch negativ getesteten Probe, wurde sequenziert und mittels Geneious Prime analysiert.
Die Probit-Analyse ergab eine Nachweisgrenze von 58,5 RNA-Kopien/Reaktion. Die RT-RPA amplifizierte keine Nukleinsäuren der 17 getesteten anderen Pathogenen, zeigte jedoch eine Kreuzreaktion mit dem Caninen Coronavirus und dem Transmissiblen Gastroenterits-Virus. Der Vergleich der Resultate der real-time RT-PCR mit den 39 extrahierten Kotproben und den Ergebnissen der RT-RPA ergab eine Sensitivität von 90,9% und eine Spezifität von 100%. Bei der Sequenzierung wurde keine Sequenzänderung in der Region von Primern und Sonde festgestellt.
Die RT-RPA hat sich als schnelle und effektive Maßnahme für den Nachweis von FCoV in extrahierten Kotproben herausgestellt. Die einfache Handhabung der RPA macht wiederholtes Testen möglich, um auch die intermittierenden Ausscheider zu erkennen. Die Anwendung des Schnelltests könnte so zu einer Reduktion von FCoV innerhalb der Katzenpopulationen beitragen.:Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 3
2.1 Felines Coronavirus 3
2.1.1 Virus Klassifikation 3
2.1.2 Struktur und Genom 4
2.1.3 Virusevolution 6
2.2 Epidemiologie und Krankheitsverlauf 8
2.2.1 Übertragung und Umweltstabilität 8
2.2.2 Krankheitsverlauf 9
2.2.3 Prävalenz 12
2.2.4 Prävention 13
2.2.5 Behandlung 13
2.2.6 Impfung 14
2.3 Diagnostik 15
2.3.1 Indirekter Erregernachweis 15
2.3.2 Direkter Erregernachweis 17
3. Publikation 27
3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation 27
3.2 Publikation 27
4. Diskussion und Schlussfolgerung 40
5. Zusammenfassung 47
6. Summary 49
7. Literaturverzeichnis 51
8. Abbildungsverzeichnis 64
9. Tabellenverzeichnis 64
10. Anhang 65
11. Danksagung 72
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:79503 |
| Date | 15 June 2022 |
| Creators | Kobialka, Rea Maja |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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