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Previous issue date: 2016-06-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Bothrops asper is one of the main species of Central America because of its medical importance in countries such as Panamá and Costa Rica, where they cause a high number of accidents. A great number of basic phopholipase A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) this species have been characterized, but a few number of studies have been carried out with acidic isoforms. Moreover, as the snake venom is a rich source of bioactive, the investigation of the biotechnological potential is required. Therefore, from the B. asper venom, this study
shows three main lines of research: the caracterization of novel PLA2s isoforms; the study of PLA2s in poisoning pathophysiology and the study of potential antiparasitic of PLA2s. The snake venom was fractionated on three chromatographic methods that have proved effective in purification: ion exchange, hydrophobic interaction and reversed phase,
giving rise to nine PLA2, four acidic (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV)
and five basic (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). The molecular weight was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) showed values ranging between 13.8 and 14.3 kDa. The isoelectric point of the acidic PLA2 were determined by 2D SDS-PAGE, showing pI values between 4.6 and 5.0. The N-terminal sequence of nine PLA2 was determined, and 05 are new [four Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III
and BaspAc-IV) and one Lys49 (BaspB-II)]. The enzymatic activity and the evaluation of the preferred substrates by PLA2 Asp49 was performed using fluorescent phospholipids which was observed that, among the tested phospholipids, acid PLA2
catalyzed all substrates, however, the basic PLA2 showed the highest specificity for phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid. A discussion about the role of acidic PLA2
in case of poisoning by snake bite is performed based on myotoxicity assay. Moreover, it
is demonstrated the antiparasitic action of these molecules, since the acidic PLA2
(BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) showed effects against epimastigote and pomastigotes forms of Trypanossoma cruzi and Leishmania infantum respectively.
On the other hand, the basic PLA2, BaspB-II and IV-BaspB showed activity against
Plasmodium falciparum. Furthermore, for the first time it demonstrated the synergistic action between Lys49 and Asp49 PLA2s against the malaria parasite, demonstrating that these molecules might be important targets in the development of new therapeutics.
Keywords: Snake Venoms, Bothrops Asper, Phospholipase A2, Venomics, Synergism in Parasiticide Action / A serpente Bothrops asper é uma das espécies mais importantes da América Central,
principalmente, por sua importância médica em países como Panamá e Costa Rica, onde causam um número elevado de acidentes. Diversas fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) básicas desta espécie já foram caracterizadas, porém poucos estudos foram realizados com as isoformas ácidas. Além disso, sendo o veneno de serpente uma rica fonte de bioativos, faz-se necessária a investigação de seu potencial biotecnológico. Desta forma, a partir do veneno de B. asper, o presente trabalho teve objetivos principais: a caracterização de novas isoformas de PLA2s, o estudo das PLA2s na fisiopatologia do envenenamento e o estudo do potencial antiparasitário das PLA2s. Para tanto, o veneno foi fracionado em três métodos cromatográficos que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa, dando origem a nove PLA2
isoladas, quatro ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e cinco básicas (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). As massas moleculares foram determinadas por espectrometria (MALDI TOF) com valores variando entre 13,8 e 14,3 kDa. Os pontos isoelétricos das PLA2s ácidas foram determinados por 2D-SDS-PAGE com valores de pI variando entre 4,6 e 5,0. A sequência N-terminal das nove PLA2s foram determinadas, sendo observado que dentre as nove, 05 são inéditas [quatro Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e uma Lys49 (BaspB-II)]. A atividade enzimática e a avaliação dos substratos preferenciais das PLA2s Asp49 foram realizadas
utilizando-se fosfolipídeos fluorescentes e observou-se que, dentre os fosfolipídeos testados, as PLA2s ácidas catalisaram a degradação de todos os substratos, entretanto, para a PLA2 básica houve preferência para o fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico. Uma discussão a respeito do papel das PLA2s ácidas no envenenamento ofídico é conduzida com base no ensaio de miotoxicidade. Ademais, é demostrado a ação antiparasitária dessas moléculas, já que as PLA2s ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-
IV) tiveram ação contra as formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. infantum e as PLA2s básicas BaspB-II e BaspB-IV apresentaram atividade contra Plasmodium falciparum. Posto isto, pela primeira vez, foi demonstrado a ação sinérgica entre uma PLA2 Lys49 e uma PLA2 Asp49 contra o parasita da malária, demonstrando
que estas moléculas podem ser importantes alvos no desenvolvimento de novos
terapêuticos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5600 |
| Date | 24 June 2016 |
| Creators | Silva, Rodrigo Simões |
| Contributors | Stábeli, Rodrigo Guerino, Soares, Andreimar Martins, Zuliani, Juliana Pavan, Calderon, Leonardo de Azevedo, Peloso, Eduardo de Figueiredo, kayano, Anderson Makoto |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal - BIONORTE, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 1984485651082134923, 500 |
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