As fosfolipases A2 secretadas, particularmente do grupo II são abundantes nos venenos de serpentes, incluindo o gênero Bothrops e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos, como inflamação e dor, incluindo artrite. Contudo, não está totalmente caracterizado o papel da FLA2 para a gênese e manutenção dos quadros de inflamação articular. Nosso objetivo foi padronizar um novo modelo de artrite, utilizando sFLA2 do grupo IIA (miotoxina II) isolada do veneno da serpente Bothrops asper e avaliar a mediação química envolvida no processo nociceptivo deste quadro. Os resultados indicaram aumento de permeabilidade vascular, infiltrado celular e hiperalgesia. A hiperalgesia é um processo multimediado com a participação de prostanóides, sendo sua produção decorrente da ativação de FLA2 endógenas. Estes dados sugerem que esta FLA2 pode se tornar uma ferramenta científica importante para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos processos de inflamação articular. / Secretory phospholipases A2 are abundant in different animal tissues and particularly group II are found in venom snakes and are proteins involved in many physiological and pathophysiological processes, like inflammation and pain, components of arthritis. However, the involvement of PLA2 in the genesis and maintenance of articular inflammation is not well characterized. Our aim is to characterize the articular inflammatory response induced by Lys 49-PLA2 (IIA group) isolated from B. asper snake venom. It was analyzed the nociceptive process involved, developing a new experimental model of articular inflammation. Our results indicated that sPLA2 induces increase in the vascular permeability, cell migration and hyperalgesia. Hyperalgesia is a multimediated process and prostanoids are involved in the nociceptive process, being its production dependent of the endogenous PLA2 activation. These data indicate that this PLA2 could be an important scientific tool for the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in articular inflammation processes.

Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina. / Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

As fosfolipases A2 secretadas, particularmente do grupo II são abundantes nos venenos de serpentes, incluindo o gênero Bothrops e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos, como inflamação e dor, incluindo artrite. Contudo, não está totalmente caracterizado o papel da FLA2 para a gênese e manutenção dos quadros de inflamação articular. Nosso objetivo foi padronizar um novo modelo de artrite, utilizando sFLA2 do grupo IIA (miotoxina II) isolada do veneno da serpente Bothrops asper e avaliar a mediação química envolvida no processo nociceptivo deste quadro. Os resultados indicaram aumento de permeabilidade vascular, infiltrado celular e hiperalgesia. A hiperalgesia é um processo multimediado com a participação de prostanóides, sendo sua produção decorrente da ativação de FLA2 endógenas. Estes dados sugerem que esta FLA2 pode se tornar uma ferramenta científica importante para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos processos de inflamação articular. / Secretory phospholipases A2 are abundant in different animal tissues and particularly group II are found in venom snakes and are proteins involved in many physiological and pathophysiological processes, like inflammation and pain, components of arthritis. However, the involvement of PLA2 in the genesis and maintenance of articular inflammation is not well characterized. Our aim is to characterize the articular inflammatory response induced by Lys 49-PLA2 (IIA group) isolated from B. asper snake venom. It was analyzed the nociceptive process involved, developing a new experimental model of articular inflammation. Our results indicated that sPLA2 induces increase in the vascular permeability, cell migration and hyperalgesia. Hyperalgesia is a multimediated process and prostanoids are involved in the nociceptive process, being its production dependent of the endogenous PLA2 activation. These data indicate that this PLA2 could be an important scientific tool for the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in articular inflammation processes.

Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina. / Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:11:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:12:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Bothrops asper is one of the main species of Central America because of its medical importance in countries such as Panamá and Costa Rica, where they cause a high number of accidents. A great number of basic phopholipase A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) this species have been characterized, but a few number of studies have been carried out with acidic isoforms. Moreover, as the snake venom is a rich source of bioactive, the investigation of the biotechnological potential is required. Therefore, from the B. asper venom, this study shows three main lines of research: the caracterization of novel PLA2s isoforms; the study of PLA2s in poisoning pathophysiology and the study of potential antiparasitic of PLA2s. The snake venom was fractionated on three chromatographic methods that have proved effective in purification: ion exchange, hydrophobic interaction and reversed phase, giving rise to nine PLA2, four acidic (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) and five basic (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). The molecular weight was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) showed values ranging between 13.8 and 14.3 kDa. The isoelectric point of the acidic PLA2 were determined by 2D SDS-PAGE, showing pI values between 4.6 and 5.0. The N-terminal sequence of nine PLA2 was determined, and 05 are new [four Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) and one Lys49 (BaspB-II)]. The enzymatic activity and the evaluation of the preferred substrates by PLA2 Asp49 was performed using fluorescent phospholipids which was observed that, among the tested phospholipids, acid PLA2 catalyzed all substrates, however, the basic PLA2 showed the highest specificity for phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid. A discussion about the role of acidic PLA2 in case of poisoning by snake bite is performed based on myotoxicity assay. Moreover, it is demonstrated the antiparasitic action of these molecules, since the acidic PLA2 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) showed effects against epimastigote and pomastigotes forms of Trypanossoma cruzi and Leishmania infantum respectively. On the other hand, the basic PLA2, BaspB-II and IV-BaspB showed activity against Plasmodium falciparum. Furthermore, for the first time it demonstrated the synergistic action between Lys49 and Asp49 PLA2s against the malaria parasite, demonstrating that these molecules might be important targets in the development of new therapeutics. Keywords: Snake Venoms, Bothrops Asper, Phospholipase A2, Venomics, Synergism in Parasiticide Action / A serpente Bothrops asper é uma das espécies mais importantes da América Central, principalmente, por sua importância médica em países como Panamá e Costa Rica, onde causam um número elevado de acidentes. Diversas fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) básicas desta espécie já foram caracterizadas, porém poucos estudos foram realizados com as isoformas ácidas. Além disso, sendo o veneno de serpente uma rica fonte de bioativos, faz-se necessária a investigação de seu potencial biotecnológico. Desta forma, a partir do veneno de B. asper, o presente trabalho teve objetivos principais: a caracterização de novas isoformas de PLA2s, o estudo das PLA2s na fisiopatologia do envenenamento e o estudo do potencial antiparasitário das PLA2s. Para tanto, o veneno foi fracionado em três métodos cromatográficos que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa, dando origem a nove PLA2 isoladas, quatro ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e cinco básicas (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). As massas moleculares foram determinadas por espectrometria (MALDI TOF) com valores variando entre 13,8 e 14,3 kDa. Os pontos isoelétricos das PLA2s ácidas foram determinados por 2D-SDS-PAGE com valores de pI variando entre 4,6 e 5,0. A sequência N-terminal das nove PLA2s foram determinadas, sendo observado que dentre as nove, 05 são inéditas [quatro Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e uma Lys49 (BaspB-II)]. A atividade enzimática e a avaliação dos substratos preferenciais das PLA2s Asp49 foram realizadas utilizando-se fosfolipídeos fluorescentes e observou-se que, dentre os fosfolipídeos testados, as PLA2s ácidas catalisaram a degradação de todos os substratos, entretanto, para a PLA2 básica houve preferência para o fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico. Uma discussão a respeito do papel das PLA2s ácidas no envenenamento ofídico é conduzida com base no ensaio de miotoxicidade. Ademais, é demostrado a ação antiparasitária dessas moléculas, já que as PLA2s ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc- IV) tiveram ação contra as formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. infantum e as PLA2s básicas BaspB-II e BaspB-IV apresentaram atividade contra Plasmodium falciparum. Posto isto, pela primeira vez, foi demonstrado a ação sinérgica entre uma PLA2 Lys49 e uma PLA2 Asp49 contra o parasita da malária, demonstrando que estas moléculas podem ser importantes alvos no desenvolvimento de novos terapêuticos.