Los fotorreceptores (FRs) son las neuronas que capturan la luz en el ojo, por lo que juegan un rol central
en la visión. La pérdida progresiva de estas células durante ciertas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa o la degeneración macular, conduce a déficits de la visión y
eventualmente a la ceguera. Estas patologías, así como otras que afectan al sistema nervioso central,
están caracterizadas por la degeneración gradual, selectiva e irreversible de una población neuronal
específica. La deficiencia de factores tróficos ha sido involucrada en muchos de estos procesos
neurodegenerativos y es característica de la denominada muerte celular programada, tal como la que
ocurre al momento de la sinaptogénesis en el desarrollo del sistema nervioso. En efecto, en la retina, así
como también en otras partes del sistema nervioso, las neuronas requieren para su supervivencia, de
factores tróficos, los cuales provienen de su entorno.
El requerimiento de factores tróficos varía según el tipo celular y la etapa del desarrollo. En particular, para
los
FRs ya se han identificado varios de ellos, incluyendo el Factor Neurotrófico Derivado de la Glía (GDNF),
el
Factor Neutrófico Ciliar (CNTF), el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), el ácido docosahexaenoico
(DHA), la esfingosina 1-fosfato (S1P) y, más recientemente, uno de los principales, el Factor Derivado del
Epitelio Pigmentario (PEDF), una proteína con funciones neurotróficas y antiangiogénicas, asociadas a
dominios separados de la proteína. La identificación de las secuencias de estos dominios ha permitido
diseñar y sintetizar químicamente péptidos estables, como los fragmentos neurotróficos 44-mer y 17-mer,
que conservan las propiedades de la proteína nativa y, por ende, de potencial valor médico. Sin embargo,
estas características ventajosas requieren ser evaluadas en un modelo experimental adecuado.
La mayoría del conocimiento actual sobre el PEDF se ha obtenido gracias a modelos in vivo, donde,
debido su inherente complejidad, sumado a la cantidad de interacciones que ocurren entre las células y
moléculas de tejidos circundantes, resulta difícil analizar los procesos involucrados. Una alternativa a este
obstáculo son los cultivos primarios elegidos para realizar esta tesis, compuestos solo de neuronas
amacrinas y FRs, las que, creciendo en medios químicamente definidos, permiten estudiarlas en un
entorno mucho más controlado que en el organismo entero. En estos cultivos, los FRs se desarrollan
independientemente, sin requerir la suplementación de factores tróficos, pero, una vez establecidas sus
conexiones sinápticas, se tornan dependientes de los mismos para continuar con su desarrollo y prolongar
supervivencia. La dependencia por estos factores hace de este sistema in vitro un modelo adecuado para
evaluar el efecto de distintas moléculas sobre la supervivencia o diferenciación celular.
Por ello, los resultados reseñados en el primer capítulo de esta tesis tuvieron como objetivo principal
evaluar el efecto de PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico y angiogénico en este
modelo de cultivo primario de neuronas de retina.
En estos cultivos, tanto los FRs como las neuronas amacrinas exhibieron el receptor de PEDF (PEDF-R),
el cual es una fosfolipasa del tipo A2, localizado principalmente en la membrana celular. Por otro lado, la
expresión del transcripto para PEDF-R mostró un patrón decreciente durante los primeros 5 días de
cultivo, así como también en la retina in vivo, en el mismo periodo de desarrollo. Este patrón se observó
también a nivel de la proteína, aunque su descenso en el tiempo fue más atenuado.
Tanto el PEDF como los dos péptidos derivados de su dominio neurotrófico, protegieron a los FRs en
cultivo de la muerte celular, caracterizada por ensayos de TUNEL y Anexina V. Además, previnieron la
pérdida de la función mitocondrial evaluada mediante Mitotracker, y preservaron la integridad estructural
de la membrana plasmática, analizada indirectamente por medio de ioduro de propidio y DAPI; dado que
estos marcadores se visualizan una vez que se altera la permeabilidad de la membrana plasmática. Esta
protección se debió principalmente a la interacción de PEDF con PEDF-R, y, en parte, al aumento
constatado en la transcripción de factores antiapoptóticos como Bcl2 y Bcl2a1. El efecto del PEDF fue
específico para la supervivencia de los FRs dado que el mismo no alteró la viabilidad de las neuronas
amacrinas, la cual se mantuvo constante durante los días de cultivo analizados. Por el contrario, el PEDF
y los péptidos 44-mer y 17-mer promovieron el desarrollo de neuritas en las neuronas amacrinas, e
indujeron la diferenciación de los FRs, al promover la polarización de la rodopsina hacia el extremo apical
de estas neuronas, tal como ocurre en los FRs maduros de la retina in vivo.
Estos efectos fueron anulados eficientemente mediante el secuestro de PEDF o de sus péptidos por medio
del péptido bloqueante P1, o por la inhibición de la actividad enzimática del PEDF-R mediante el inhibidor
enzimático selectivo atglistatin. Todos los efectos del PEDF y sus péptidos neurotróficos fueron asociados
a la interacción de los mismos con el PEDF-R. Por su parte, el fragmento derivado del dominio
antiangiogénico del PEDF no tuvo ningún efecto.
Por otro lado, también se indagó sobre el potencial del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivado de
células madre pluripotentes (CMP) en la producción y liberación del PEDF. Dado que la deficiencia del
PEDF ha sido correlacionada con una mayor incidencia de ciertas retinopatías y el hecho que el EPR
puede estar comprometido en algunas de estas patologías, ha impulsado el desarrollo de estrategias
orientadas a reemplazar el EPR dañado. Entre ellas se destaca la estrategia de generar EPR por medio
de CMP obtenidas a partir de la inducción de células somáticas mediante la transducción de factores de
pluripotencia por medio de un sistema episomal. Este tipo de estrategia requiere sortear múltiples
obstáculos antes de ser viable, particularmente el de garantizar la identidad del nuevo EPR. El objetivo de
esta línea de investigación, descripta en el segundo capítulo de esta tesis, fue evaluar los aspectos
funcionales del EPR derivado de células madre, comparándolos con los del EPR nativo.
El EPR derivado de CMP humanas recapituló las características distintivas del EPR nativo, como la
polarización baso-apical, la capacidad de fagocitar y metabolizar segmentos externos de FRs y la
producción de PEDF. Todas estas características se mantuvieron aun hasta 50 días después de su
inducción, con la producción de PEDF incrementándose significativamente en función del tiempo.
En conclusión, el PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico ejercieron efectos
citoprotectores y de diferenciación sobre los fotorreceptores y promovieron el crecimiento de neuritas en
las neuronas amacrinas. Todos estos efectos fueron dependientes de la interacción entre PEDF y PEDF-
R.
Por otro lado, el EPR derivado de CMP examinado en este trabajo de tesis mostró un comportamiento
similar al del EPR en la retina intacta, lo que permite considerar sus posibles capacidades terapéuticas
para estas enfermedades / Photoreceptors (PHRs) are the retinal neurons, which react to light, making them a central component in
the visual process. Their loss during certain retinal neurodegenerative diseases, such as retinitis
pigmentosa or age-related macular degeneration, leads to a gradual decline of vision and ultimately to
blindness. These pathologies, as well as others that target the central nervous system, are characterized
by the gradual, selective and irreversible degeneration of specific neuronal cell types. The lack of trophic
factors has been involved in many of these neurodegenerative processes and it is characteristic of the so-
called programmed cell death, such as the one that occurs during the period of synaptogenesis within the
developing nervous system. In the retina, just as any other portions of the nervous system, neurons are
dependent on trophic factors, which are produced by their environment.
Trophic factor requirements vary according to each cell type and its developmental stage. For the PHRs,
many trophic factors have been already identified, including the Glial cell line-derived Neurotrophic Factor
(GDNF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), Fibroblastic Growth Factor (FGF), docosahexaenoic acid
(DHA), sphingosine-1-phosphate (S1P) and, perhaps one of the most important among them, the Pigment
Epitheliumderived Factor (PEDF). PEDF is a protein exhibiting both neurotrophic and antiangiogenic
properties, which are conferred by two spatially-separated domains of the PEDF polypeptide. The
identification of the sequences of these domains has allowed for the design and chemical synthesis of
stable peptides, such as the neurotrophic fragments 44-mer and 17-mer, which could potentially retain the
neurotrophic properties of the native protein, and therefore having a potential therapeutic value. However,
these advantages should be first evaluated on an adequate experimental model.
Up to now, most of our knowledge regarding PEDF has been obtained through in vivo models, which, due
to their inherent complexity and the multiplicity of interactions between cells and their surrounding tissues,
makes it difficult to analyze the specific processes occurring at a smaller scale. An alternative to overcome
these limitations is the use of primary cultures chosen for the present thesis, composed solely of PHRs and
amacrine neurons cultured in a chemically defined medium. These cultures allow the study of these
neurons in a much more controlled environment when compared to a whole organism. PHRs in these
cultures, initially develop and replicate without requiring trophic factor supplementation, but once they
establish their synaptic connections, become reliant on them for their survival. This reliance makes this in
vitro system an adequate testbed to evaluate the effects of different trophic factors on cell survival and
differentiation.
Therefore, the results of the first part of the thesis, which are shown in the first chapter, have the main
objective of evaluating the effects of PEDF and peptides derived from its neurotrophic and antiangiogenic
domains in a primary retinal cell culture-based model.
In these cultures, both neuronal types exhibited the PEDF receptor (PEDF-R), which was primarily
localized in the cell membrane. Additionally, the expression patterns for the PEDF-R transcript showed a
decreasing trend on the first 5 days in culture, which was also observed in the in vivo environment. This
pattern was also observed at the protein level, albeit in a less dramatic fashion.
PEDF as well as its neurotrophic domain-derived peptides protected cultured PHRs from cell death, which
was measured by TUNEL and Annexin V assays. Furthermore, they also prevented the loss of
mitochondrial function, as evaluated by Mitotracker, and preserved the structural integrity of the plasma
membrane analyzed by propidium iodide and DAPI staining, given that these markers are visualized once
the plasma membrane permeability is altered. This protection was exerted through PEDF/PEDF-R
interaction, along with the upregulation of antiapoptotic factors such as Bcl2 and Bcl2a1. This protective
effect was PHR-specific, given that there was no significant difference in the survival rate of amacrine
neurons, which was constant throughout the observed timeframe. Furthermore, PEDF and the 44-mer and
17-mer peptides promoted neurite outgrowth in amacrine neurons and induced PHR differentiation by
promoting apical rhodopsin polarization, mimicking the same process in the retina in vivo.
These effects were readily annulled either by sequestering PEDF or its derived neurotrophic peptides with
the blocking P1 peptide, or by inhibiting the enzymatic activity of PEDF-R with the selective enzymatic
inhibitor atglistatin. Every previously observed effect, exerted by PEDF or its neurotrophic peptides, was
linked to their interaction with PEDF-R. The antiangiogenic domain-derived peptide showed no effects
whatsoever.
In a second line of research carried out in this thesis and described in the second chapter of this thesis, I
delved on the potential PEDF production and secretion of induced pluripotent cell-derived retinal pigmented
epithelium (RPE). Due to the fact that PEDF deficit has been correlated with an increased incidence of
retinopathies, coupled with the observation that the pigmented epithelium itself is compromised in several
of them; has led to the emergence of novel therapeutic strategies based on replacing the damaged retinal
pigmented epithelium. One of the main approaches relies on generating RPE by the differentiation of
induced pluripotent stem cells, obtained by the transduction of pluripotency factors in somatic cells by
means of an episomal system. This approach must clear several hurdles before becoming viable, starting
with confirming the identity and properties of this new RPE and how it compares to native RPE.
The stem cell-derived human RPE was able to replicate the main hallmarks of native RPE, such as
basalapical polarization, the capacity to phagocyte and metabolize PHR outer segments and to secrete
PEDF. All these features were consistent even at 50 days post-induction, with PEDF secretion showing a
significant increase over time.
In conclusion, PEDF and its neurotrophic peptides exerted cytoprotective effects and stimulated neuronal
development on photoreceptors and promoted neurite outgrowth amacrine neurons. All of these effects
were driven by PEDF/PEDF-R interaction.
Furthermore, stem cell-derived RPE showed a similar behavior to native RPE, allowing this approach of
RPE replacement to be further considered as another potential therapeutic approach for the treatment of
these diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/6339 |
| Date | 07 March 2023 |
| Creators | Michelis, Germán Ariel |
| Contributors | Politi, Luis E., Becerra, Sofía Patricia |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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