Estudos com tratamento hipertérmico de tumores utilizando nanopartículas metálicas têm sido realizados durante as últimas décadas e mostram resultados bons quanto à remissão de tumores, por vezes chegando à cura completa. O mesmo acontece em relação aos tratamentos baseados em ação fotodinâmica de fotossensibilizadores. Tratamentos aliando a terapia hipertérmica com nanopartículas de ouro e a terapia fotodinâmica com diversos fotossensibilizadores tem efeito sinérgico e apresenta excelente potencial terapêutico, em que pese serem necessários mais estudos para que uma nova terapia conjunta possa ser implementada. A proposta deste trabalho foi investigar esse efeito sinérgico utilizando nanobastões de ouro complexados com fotossensibilizadores. Após a síntese dos nanobastões pelo método de seeding, a eficácia do tratamento fotodinâmico e da terapia hipertérmica, separadamente, foi investigada. A metodologia do recobrimento dos nanobastões por fotossensibilizador, em um primeiro momento, não logrou êxito com a porfirina, porém com a ftalocianina tetracarboxilada se mostrou mais eficaz. A taxa de fotodegradação da ftalocianina em solução foi investigada como parâmetro para a eficiência em geração de oxigênio singlete. Após centrifugação e lavagem das nanopartículas, no entanto, evidenciou-se por espectrofotometria que o fotossensibilizador não permaneceu aderido aos nanobastões. Em um segundo momento, optamos por recobrir os nanobastões por porfirinas tetrassulfonadas, com ou sem grupamentos metil-glucamina. Após o processo de recobrimento, essas ftalocianinas formaram complexos iônicos com o CTAB que recobre os nanobastões. Os complexos nanobastões-ftalocianinas foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão e as taxas de geração de oxigênio singlete e de radical hidroxil foram investigadas. Além disso, foram utilizadas para testes in vivo e in vitro com células de melanoma melanótico (B16F10) ou amelanótico (B16G4F). As células tumorais em cultura ou os tumores em camundongos C57BL6 foram irradiados com luz em 635 nm e os tumores foram observados por 15 dias após o tratamento. Houve evidente aumento na geração de oxigênio singlete por ambos fotossensibilizadores, e maior geração de radicais livres por parte do fotossensibilizador metilglucaminado. O oposto ocorre com o fotossensibilizador sem metilglucamina. Houve, também, moderada citotoxicidade no escuro quando células foram incubadas com nanopartículas recobertas por ftalocianinas ou não. Quando ativados pela luz, os complexos ftalocianinas-nanobastões desencadearam um aumento de 5ºC no meio de cultura das células, e a morte celular observada foi extensa (91% para a linhagem B16G4F e 95% para a linhagem B16F10). Tanto os resultados in vitro quanto os in vivo indicam que as propriedades das ftalocianinas testadas são melhoradas significativamente quando elas estão complexadas aos nanobastões. Este é um estudo pioneiro por utilizar duas porfirinas tetrassulfonadas específicas e por utilizar o mesmo comprimento de onda para a ativação dos fotossensibilizadores e nanobastões. / Studies with hyperthermic tumor ablation using metallic nanoparticles have been performed on the last decades, and show promising results on tumor remission, sometimes achieving the complete cancer elimination. The same occurs regarding on treatments based on photodynamic activity of photosensitizer compounds. Studies indicate that those therapeutic interventions - hyperthermic therapy using gold nanorods and photodynamic activity with many photosensitizers - together can present a synergistic effect, and offer a great therapeutic potential, although more investigation needs to be performed before such approach could be implemented. We proposed to investigate the effect of the attachment of photosensitizers onto the surface of gold nanorods (well-characterized devices for hyperthermia generation). After nanorods synthesis through a seed-mediated method, the PDT and hyperthermia\'s efficacy was assessed separately. The method used for covering the gold nanorods with photosensitizers did not permit, in a first approach, the attachment of porphyrins onto the nanoparticles surface, but the attachment of tetrasulfonated phthalocyanines was more successful. The phthalocyanine\'s degradation rate was assessed as an indirect parameter of singlet oxygen generation. After centrifuging and washing the nanoparticles, we saw that the photosensitizers do not keep attached to the nanorods. On a second approach, we chose to recover the nanorods with two zinc phthalocyanines - with or without methyl-glucamine groups. After the recovering process, the phthalocyanines formed ionic complexes with the CTAB that is previously recovering the nanoparticles. The nanorod-phthalocyanines complexes were analyzed by TEM, and their singlet oxygen and hydroxyl radical generation yield were assessed. Furthermore, they were tested in vitro in melanoticB16F10 and amelanotic B16G4F melanoma cells, and in vivo. The tumor cells (in vitro) and the tumor tissue (in vivo) with nanoparticles were irradiated with laser (at 635 nm), and the tumor growth in mice was observed for 15 days after the laser irradiation. It is evident the increase in the singlet oxygen generation, and higher HPF activation for the glucaminated Pc, but the inverse for the other photosensitizer. It seems like there is a type I to type II switch on the action mechanism of the latter Pc. A mild cytoxocity was observed with the nanorods conjugated with photosensitizer in the dark, but when they are activated by light (and taken into account a 5ºC rise in the temperature because of the surface plasmon resonance from the gold nanorods), the cell killing is intense (91% for B16G4F cell line, and 95% for B16F10 cell line). Both in vitro and in vivo results indicate that the photodynamic properties of the phthalocyanines tested are enhanced when they are attached onto the nanorods surface. This is a novel study because we used two tetrasulfonated phthalocyanines and because we used the same wavelength to activate both the nanorods and the photosensitizers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22062016-111916 |
| Date | 26 February 2016 |
| Creators | Freitas, Lucas Freitas de |
| Contributors | Plepis, Ana Maria de Guzzi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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