Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30052003-144303 |
| Date | 25 July 1997 |
| Creators | Miletti, Luiz Claudio |
| Contributors | Alves, Maria Julia Manso |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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