Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Oxidative stress is an important molecular mechanism of lead (Pb) toxicity. The thioredoxin
system (selenoenzyme thioredoxin reductase-TrxR, thioredoxin protein- Trx and NADPH) is essential
for the antioxidant defense and cellular redox control. In our previous study, it was showed that
cytosolic renal TrxR1 activity of rats increased after acute and long-term exposure to Pb and this was
the only parameter that changed after both exposures to low Pb doses. Then, it was suggested that
TrxR1 could operate in the early defense against Pb toxicity and it could also be used as a bioindicator
of early effects of Pb. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the role of thioredoxin
system in Pb-induced changes, evaluating: I) in vitro the activity of purified TrxR1, as well as the
activity and the protein expression of TrxR1 and Trx1 in renal HEK 293 culture cells exposed to Pb; II)
in vivo, the effects of Pb exposure in rats and in occupationally-exposed humans on renal (only in rats)
and blood TrxR1 activity (both rats and humans), comparing these effects to oxidative stress
parameters, as well as to classical bioindicators of Pb effect and exposure. The results of the in vitro
study showed that lead is a less potent inhibitor of the purified TrxR1 activity (IC50 = 0.27 TM) than its
structural homologous glutathione reductase (IC50 = 0.048 TM). TrxR1 inhibition was independent on
the selenocysteine residue of the active site and was reversible by bovine serum albumin and by the
EDTA chelating. TrxR1 inhibition also occurred in HEK 293 cells exposed to the highest Pb acetate
concentration (60 TM), without alterations in protein expression. However, under glutathione (GSH)
depletion after pre-incubation of cells with L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) and further exposure
to Pb, the activity and expression of both TrxR1 and Trx1 increased in the absence of cytotoxicity and
of changes in GR and glutathione S-transferase activities, which indicates Trx system as an important
protective mechanism against Pb toxic effects in GSH-depleted cells. On the other hand, blood TrxR1
activity did not change either after acute exposure of rats or long-term exposure of humans to Pb.
However, the increase of renal TrxR1 activity in rats exposed to the highest dose of Pb acetate (25
mg/kg) occurred concomitantly with the increase of blood and renal Pb levels over time (6, 24 e 48 h),
whereas the erythrocyte δ-ALA-D inhibition, which is a classical indicator of Pb effects, occurred after
6 h of exposure and the activity was further recovered (at 24 and 48 h). Moreover, the increase of
renal TrxR1 activity occurred without renal histopathologycal damage, which corroborates the increase
of this enzyme as an early event of Pb toxicity. Overall, the results of the current study point out the
thioredoxin system as a target for Pb, but mainly as a protective mechanism against Pb toxicity.
However, the absence of changes in blood TrxR1 activity in Pb-exposed animals and humans
indicates that this enzyme is not an appropriate bioindicator of the toxic effects of Pb in exposed
populations. / O estresse oxidativo é um importante mecanismo molecular da toxicidade do chumbo (Pb).
O sistema da tiorredoxina (selenoenzima tiorredoxina redutase -TrxR, proteína tiorredoxina -Trx e
NADPH) é essencial na defesa antioxidante e no controle redox celular. Em nosso estudo prévio, foi
demonstrado que a atividade da enzima TrxR1 (citosólica) renal de ratos aumentou na exposição
aguda e prolongada ao Pb, sendo o único parâmetro alterado em ambas exposições a doses baixas
de Pb. Assim, foi sugerido que a TrxR1 atuaria precocemente na defesa contra a toxicidade do metal,
podendo também ser utilizada como um bioindicador dos efeitos precoces do Pb. Assim, o objetivo
geral desta tese foi investigar o papel do sistema da tiorredoxina nas alterações induzidas pelo Pb,
avaliando: I) in vitro a atividade da TrxR1 purificada, bem como a atividade e expressão protéica da
TrxR1 e Trx1 em culturas de células renais HEK 293 expostas ao Pb e II) in vivo, os efeitos do Pb em
ratos e em humanos ocupacionalmente expostos ao Pb sobre a atividade da TrxR1 renal (somente
em ratos) e sanguínea (ratos e humanos), comparando esses efeitos com parâmetros de estresse
oxidativo, bem como com indicadores clássicos de efeito e de exposição ao Pb. Os resultados do
estudo in vitro mostraram que a atividade da enzima TrxR1 purificada foi inibida pelo Pb (IC50 = 0.27
TM) de forma menos potente que a sua homóloga estrutural glutationa redutase (IC50 = 0.048 TM).
Essa inibição foi independente do resíduo de selenocisteína do sítio ativo da TrxR1 e foi revertida
pela albumina sérica bovina e pelo quelante EDTA. A inibição da TrxR1 também ocorreu em células
HEK 293 expostas à maior concentração de acetato de Pb (60 TM), sem alterações na expressão
protéica. Entretanto, quando os níveis celulares de glutationa (GSH) foram depletados por pré
incubação das células com L-butionina-[S,R]-sulfoximina (BSO) e posterior exposição ao Pb, a
atividade e a expressão da TrxR1 e da Trx1 aumentaram na ausência de citotoxicidade e de
alterações nas atividades da GR e glutationa S-transferase, apontando esse sistema como um
importante mecanismo contra a toxicidade do Pb em células sob depleção de GSH. Por outro lado, a
atividade da TrxR1 sanguínea não alterou na exposição aguda de ratos e prolongada de humanos ao
Pb. No entanto, o aumento da atividade da TrxR1 renal em ratos expostos à maior dose de acetato
de Pb (25 mg/kg) foi concomitante com o aumento dos níveis sanguíneos e renais de Pb ao longo do
tempo (6, 24 e 48 h), enquanto que a inibição da enzima δ-ALA-D eritrocitária, um indicador clássico
de efeito do Pb, ocorreu após 6 h de exposição, sendo sua atividade restabelecida posteriormente
(24 e 48 h). Além disso, o aumento da atividade da TrxR1 renal ocorreu sem danos histopatológicos
renais, confirmando essa alteração como um evento precoce da toxicidade do Pb. Em geral, os
resultados do presente estudo apontam o sistema da tiorredoxina como alvo do Pb, mas
principalmente como um mecanismo de proteção contra o metal. Entretanto, a ausência de alterações
na atividade da TrxR1 sanguínea em animais e humanos expostos ao Pb, indica que essa enzima
não é um bioindicador adequado dos efeitos tóxicos do Pb em populações expostas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4445 |
| Date | 30 November 2011 |
| Creators | Conterato, Greicy Michelle Marafiga |
| Contributors | Emanuelli, Tatiana, Bonan, Carla Denise, Schetinger, Maria Rosa Chitolina, Pereira, Maria Ester, Brandão, Ricardo |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica, UFSM, BR, Bioquímica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 200800000002, 400, 500, 300, 500, 500, 500, 500, 7812e191-0e91-4b97-bc2b-b442502f0186, 5a29c887-009b-43c5-8042-fdfb7fe64a17, 64d05617-eaff-4cb5-8519-d7dc8a467932, 93acb9e6-39fa-412c-84a4-a90a4863b53e, 8715a925-41b6-4b21-bdcf-a45ad2f0af9a, a0549035-0247-4ccd-b20c-68a4cb6258a6 |
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