Le paludisme est une maladie dévastatrice causée par un parasite du genre Plasmodium. Du fait de la propagation de souches résistantes aux actuels antipaludéens, il est nécessaire de comprendre les fonctions physiologiques essentielles du parasite afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Les transporteurs membranaires sont une classe importante de cibles chez l'homme du fait de leur rôle physiologique essentiel pour la cellule. Cependant, chez les parasite du genre Plasmodium, seulement quelques transporteurs ont été biochimiquement caractérisés. Des études récentes de délétion de gènes dans un model murin ont montrées que l’ATPase de type P4, ou flippase, ATP2 de Plasmodium est essentielle pour le parasite. Chez les Eucaryotes, l’activité de translocation des lipides des ATPases de type P4 est nécessaire pour maintenir l’asymétrie des membranes, un élément clé dans de nombreux processus essentiels comme la formation de vésicules ou l’apoptose. Les flippases forment des complexes hétéromériques avec les protéines de la famille Cdc50 qui sont également trouvées dans le génome de Plasmodium. Pour comprendre le rôle fonctionnel de ces transporteurs putatifs durant l’infection par le parasite, nous avons besoin d’étudier leur mécanisme de transport et d’identifier leur (s) substrat (s). Nous avons entrepris l’expression hétérologue chez Saccharomyces cerevisiae d’ATP2, en complexe avec les sous unités Cdc50, de trois espèces différentes de Plasmodium. Nous avons réussi à co-exprimer l’orthologue ATP2 de P. chabaudi (PcATP2) et les sous unités PcCdc50 correspondantes. Par co-immunoprécipitation et une chromatographie d’exclusion stérique détectée par fluorescence, nous sommes parvenus à identifier la sous unité s’associant à PcATP2 : PcCdc50.1. Nous avons ensuite purifié le complexe PcATP2/PcCdc50.1 en utilisant des nanobodies reconnaissant la GFP fusionnée à l’extrémité C-terminale de PcATP2 et nous avons initié la caractérisation fonctionnelle avec des tests de phosphorylation et d’activité ATPasique. / Malaria is a devastating disease caused by a parasite of the genus Plasmodium. Due to the spread of strains resistant to current antimalarial drugs, it is necessary to understand essential physiological functions of the parasite in order to find new drug targets. Membrane transport proteins are an important class of drug targets in humans, as they perform essential physiological roles of the cell. However, for Plasmodium parasites, just a few membrane transporters have been biochemically described. Recent gene-deletion studies in malaria mouse models have shown that the Plasmodium P4-ATPase, or lipid flippase, ATP2 is essential for the parasite. In eukaryotes, the phospholipid translocation activity of P4-ATPases is needed to maintain the asymmetric distribution of membranes, a key element in many essential processes like vesicle budding or apoptosis. Lipid flippases form heteromeric complexes with members of the Cdc50 protein family, also found in the genomes of Plasmodium parasites. To understand the functional role of these still putative transporters during malaria infection we need to study their transport mechanism and identify their substrate(s). We have conducted the heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae of ATP2 in complex with the Cdc50 subunits from three different Plasmodium species. We succeeded to co-express the ATP2 ortholog of P. chabaudi (PcATP2) and the related putative PcCdc50 proteins. By co-immunoprecipitation and Fluorescence-detection Size Exclusion Chromatography, we have managed to identify the Cdc50 β-subunit that associates to PcATP2: PcCdc50.1. We then purified the complex PcATP2/PcCdc50.1 using immobilized nanobodies that recognize the GFP fused at the C-terminal end of PcATP2 and we initiated the functional characterization using ATPase and phosphorylation activity assays.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018SACLS447 |
| Date | 23 November 2018 |
| Creators | Lamy, Anaïs |
| Contributors | Paris Saclay, Vazquez-Ibar, José Luis |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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