Einleitung: Die Osteoarthritis ist für einen Großteil der Lahmheiten beim Pferd
verantwortlich. Durch die starken Belastungen der equinen Gelenke schreitet die
Osteoarthritis unweigerlich fort und setzt diese Tiere einem hohen Leidensdruck aus. Bisherige Therapien reichen nicht aus, um in osteoarthritischen Gelenken die
physiologische Integrität des Knorpels wiederherzustellen. Humane und caprine
nasale Knorpelzellen zeigten in präklinischen und klinischen Studien ein hohes
Regenerationspotential und eine hohe Integrität nach autologer Implantation in
Defekte des Gelenkknorpels. Dies wurde auf ihr „Hox-Gen-negatives“
Expressionsprofil zurückgeführt, das sich nach der Implantation dem des artikulären
Knorpels anpasste.
Ziel der Studie: Das Hox-Genexpressionsprofil nasaler Chondrozyten sollte mit denen artikulärer Chondrozyten in der Zellkultur verglichen werden, um den nasalen Knorpel auch beim Pferd als mögliche autologe Knorpelquelle zu identifizieren.
Tiere, Material und Methoden: Knorpelgewebe wurde von 7 verstorbenen Pferden
aus dem Nasenseptum und einem vorderen sowie hinterem Fesselgelenk
entnommen, Chondrozyten isoliert und bis zur vierten Passage zweidimensional
kultiviert. Während der Kultivierung wurden die Chondrozyten alle 3 bis 4 Tage mittelseines eigens erstellten Beurteilungsbogens evaluiert. Zellen aus der ersten (T1) und der dritten (T2) Subkultivierung wurden lysiert, die RNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Es folgte eine qPCR, um die Expressionslevel von drei Hox-Genen (A3, D1, D8) und zwei knorpeltypischen Genen (SOX9, Kollagen II) an den drei verschiedenen Lokalisationen während T1 und T2 zu bestimmen. Die Quantifizierung der relativen Genexpression erfolgte anschließend mit der ΔΔCT-Methode unter Verwendung von RPL32 und GAPDH als Housekeeping-Gene. Zur statistischen Auswertung wurden die Multiple Lineare Regression, eine einfaktorielle
Varianzanalyse (ANOVA) und ein zweiseitiger t-Test herangezogen. Die Signifikanzniveaus aller statistischen Tests wurden auf α= 0,05 festgesetzt.
Ergebnisse: Die Hox-Genexpressionen unterschieden sich in Bezug auf die drei
Lokalisation und die Messzeitpunkte nicht signifikant voneinander. Die nasalen
Chondrozyten wiesen während der ersten Subkultivierung gegenüber den artikulären Chondrozyten signifikant höhere Kollagen-II-Expressionen auf. Eine „Hox-Gen-negative“ Expression konnte für die Tierart Pferd nicht bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Pferde wahrscheinlich ein speziesspezifisches Hox- Gen-Expressionsmuster aufweisen und dass die equinen Hox-Genexpressionsprofile statistisch signifikanten individuellen Einflüssen unterliegen.
Schlussfolgerung: Das equine Hox-Genexpressionsprofil unterliegt statistisch
signifikanten individuellen Einflüssen, die bei einer potenziellen Zelltherapie zu
beachten sind. Nasale Chondrozyten eignen sich beim Pferd aufgrund ihrer
genetischen Ähnlichkeit, bezogen auf die Expressionen der untersuchten Hox-Gene, zu artikulären Chondrozyten und ihrer hohen Bereitschaft zur Kollagen-II-Bildung wahrscheinlich als potenzielle Quelle für die autologe chondrozytäre Implantation (ACI).:1. Einleitung ...................................................................................................... 1
2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2
2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2
2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2
2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3
2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3
2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6
2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8
2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8
2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9
2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10
2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12
2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13
2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13
2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15
2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17
2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17
2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19
2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21
2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22
2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22
2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23
2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25
3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27
4. Publikation ................................................................................................ 28
5. Diskussion................................................................................................. 45
5.1 Primer ....................................................................................................46
5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47
5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49
5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50
5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51
5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53
5.7 Ausblick ................................................................................................ 53
6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55
7. Zusammenfassung ................................................................................... 56
8. Summary .................................................................................................. 58
9. Referenzen .............................................................................................. 60
9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60
9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71
10. Anhang .................................................................................................. 72
10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72
10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73
10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74
11. Danksagung .......................................................................................... 75 / Introduction: Osteoarthritis is responsible for most of the lameness in horses. Due to severe stress on equine joints, osteoarthritis inevitably progresses and results in a high degree of suffering. Current therapeutic options are not sufficient to restore the
physiological integrity of the cartilage in osteoarthritic joints. Human and caprine nasal chondrocytes demonstrated high regenerative potential and integrity after autologous implantation into articular cartilage defects in preclinical and clinical studies. This was attributed to their “Hox gene negative” expression profile, matching the profile of articular cartilage after implantation.
Aim of the study: The Hox gene expression profile of nasal chondrocytes was compared with those of articular chondrocytes in a cell culture to address nasal cartilage as a possible autologous source also in horses.
Animals, Material and Methods: Cartilage was harvested from the nasal septum, one anterior and one posterior fetlock joint of deceased 7 horses, chondrocytes were isolated and cultured two-dimensionally until the fourth passage. During cultivation, chondrocytes were evaluated every 3 to 4 days using a specially designed assessment sheet. Cells were harvested during the first (T1) and third (T2) subcultivation. RNA was extracted and transcribed into cDNA. Subsequently, qPCR was performed to determine the expression levels of three Hox genes (A3, D1, D8) and two tissue-identifying genes (SOX9, collagen II) of the three locations after T1 and T2. Quantification of relative gene expression was performed with the ΔΔCT method using RPL32 and GAPDH as housekeeping genes. Multiple linear regression, one-way analysis of variance (ANOVA), and two-tailed t-test were used for statistical analysis. The significance levels of all statistical tests were set at α= 0.05.
Results: Hox gene expressions were not significantly different in terms of localization
and measurement time points. Nasal chondrocytes exhibited significantly higher
collagen II expression than articular chondrocytes during the first subcultivation. 'Hox gene negative' expression could not be confirmed in horses. This study demonstrates that equine Hox gene expression pattern is likely species-specific and that equine Hox gene expression profiles are subject to statistically significant individual influences.
Conclusion: The equine Hox gene expression profile is subject to statistically
significant individual influences that should be considered in potential cell therapy.
Nasal chondrocytes are probably suitable as a potential source for autologous
chondrocyte implantation (ACI) in horses due to their genetic similarity, in terms of the expressions of the examined Hox genes, to articular chondrocytes and their high
propensity for collagen II formation.:1. Einleitung ...................................................................................................... 1
2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2
2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2
2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2
2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3
2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3
2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6
2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8
2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8
2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9
2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10
2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12
2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13
2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13
2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15
2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17
2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17
2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19
2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21
2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22
2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22
2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23
2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25
3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27
4. Publikation ................................................................................................ 28
5. Diskussion................................................................................................. 45
5.1 Primer ....................................................................................................46
5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47
5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49
5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50
5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51
5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53
5.7 Ausblick ................................................................................................ 53
6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55
7. Zusammenfassung ................................................................................... 56
8. Summary .................................................................................................. 58
9. Referenzen .............................................................................................. 60
9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60
9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71
10. Anhang .................................................................................................. 72
10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72
10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73
10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74
11. Danksagung .......................................................................................... 75
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:81984 |
| Date | 04 November 2022 |
| Creators | Storch, Christiane |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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