MicroRNAs (miRNAs) são RNA de fita simples (22 nucleotídeos) que atuam como reguladores da expressão gênica celular. Estudos recentes têm demonstrado o papel dos miRNAs como moduladores da resposta celular frente às infecções virais. O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus que apresenta genes estruturais comuns aos demais, além dos genes tax e rex, os quais dão origem às proteínas regulatórias. Entre elas, destaca-se a oncoproteína Tax, que é capaz de modular a expressão de genes celulares e virais, além de estar associada ao desencadeamento de patologias. Destacam-se duas manifestações clínicas associadas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Fatores relacionados ao hospedeiro também estão correlacionados ao aparecimento das patologias. No intuito de estabelecer se miRNAs humanos podem influenciar em processos celulares que se encontram desregulados pela Tax (diferenciação, transdução de sinais, apoptose, proliferação celular e tumorigênese), o objetivo deste projeto foi analisar a expressão de miRNAs em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos infectados HTLV-1. Para tanto, realizamos análises in silico para mapear alvos de miRNAs humanos no gene tax do HTLV-1. Foram utilizados dois algoritmos (miRanda e RNAhybrid), com os seguintes parâmetros: score de 120 na região da semente; energia livre de até -15 kcal/mol. Assim, selecionou-se os hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Adicionalmente, foi observado que as regiões do gene tax, onde se ligam os miRNAs selecionados, são extremamente conservadas entre os diferentes subtipos de HTLV-1. Após estas análises in silico, realizou-se a validação dos miRNAs eleitos. Para tanto, foram isolados PBMC de 21 amostras de indivíduos-controle (CT), 10 portadores assintomáticos do HTLV-1 (HAC) e 12 com HAM/TSP (HAM). Do total de células, 1x106 tiveram seu DNA genômico extraído para quantificação da carga proviral (CPV) pela metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR); 1x106 foram criopreservadas para quantificação de Tax por citometria de fluxo; 1x 107células foram utilizadas na extração de RNA para validação dos miRNAs por qRT-PCR. A fase orgânica do Trizol® foi utilizada para extração de proteínas totais e posterior análise da expressão de Tax por Western blot. A CPV apresentou-se significativamente aumentada (p= 0,0046) no grupo HAM, quando utilizado teste de Mann-Whitney. A expressão de Tax apresentou correlação significativa (p=0,0128) com a CPV, pelo teste de Spearmann e auxiliou na caracterização dos pacientes. O nível de expressão dos miRNAs foi avaliado nos grupos: CT vs Pacientes e CT vs HAC vs HAM por testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-wallis, respectivamente. Os miRNAs se mostraram desregulados no grupo de pacientes quando comparado ao grupo CT. Dentre estes, o hsa-miR-125b encontra-se aumentado significativamente no grupo de pacientes em relação ao controle (p=0,0285). Utilizou-se o teste de correlação de Spearmann, para associar a expressão de Tax com os miRNAs, porém os resultados encontrados não foram significativos. Apesar de não estar correlacionado com expressão de Tax, o hsa-miR-125b é responsável pela regulação de diversas proteínas, como TNF-, uma proteína inflamatória hiper-expressa em portadores do HTLV-1. Deste modo, acreditamos que este miRNA estaria aumentado proporcionalmente na tentativa de inibir a tradução desta proteína. Os resultados deste projeto sugerem a importância de esclarecer como os miRNAs humanos podem regular a infecção pelo HTLV-1 e gerar informações para o desenvolvimento de estratégias que possam interferir com a replicação e patogênese viral. / MicroRNAs (miRNAs) are simple strand RNA (22 nucleotides), which are regulators of cellular gene expression. Recent studies have been showed miRNAs role as modulators of cellular responses, when viral infection occurs. The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus that presents the same regular structural genes compared to the other retrovirus, besides tax and rex genes, which encode regulatory proteins. In regard to this, Tax oncoprotein is a major determinant of viral persistence and pathogenesis. Two major diseases are related to this virus adult T cell leukemia (ATLL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Host-related factors are also correlated with HAM/TSP development. To establish if human miRNAs could influence in the unregulated cellular process caused by Tax (differentiation, signal transduction, apoptosis, cellular proliferation and tumorigenesis), this study analyzed miRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HTLV-1 infected patients. For this purpose, we performed in silico analyses to find human miRNAs that could targeted HTLV-1 tax region. We performed two algorithms (miRanda e RNAhybrid) and we set up two distinct parameters: score more than 120 in the seed region and minimum free energy until -15 kcal/mol. So, we have selected these hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Besides this, we compared several HTLV-1 sub-types and we observed that regions, where miRNAs are regulating, are extremely conserved. After the in silico analysis, we validated miRNAs that we have been chosen. We isolated PBMC samples from 21 control-individuals (CT), 10 from asymptomatic carriers and 12 from HAM/TSP (HAM). After the procedure, genomic DNA were extracted from 1x106 cells, in order to quantify the proviral load (PL) performing quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Tax was measured by flow cytometry and for this procedure, we used 1x106 criopreserved cells. Amount 1x 107cells were used to total RNA extraction that was used to miRNAs validation by qRT-PCR. The organic phase from Trizol® was employed to extract total proteins, which were used to analyze Tax expression by Western blot. The PL was significantly higher in HAM group than HAC (p= 0,0046), when Mann-Whitney statistical test was employed. The Tax expression was significantly correlated to PL (p=0,0128) by Spearmann test and this finding provided us a better characterization of the patients. The miRNAs expression was detected in the following groups: CT vs Patients and CT vs HAC vs HAM by non-parametrical tests Mann-Whitney and Kruskal-wallis, respectively. The miRNAs presented unregulated themselves in the patient group, when we compared to CT group. We observed that hsa-miR-125b expression are significantly higher in patients group than controls (p=0,0285). We have tried to associate miRNAs with Tax expression, employing Spearmann test, but this analysis did not show significant values. Despite this, hsa-miR-125b is responsible for regulating several proteins, such as TNF-, which is an inflammatory protein overexpressed in HTLV-1 carriers. In conclusion, we propose that this miRNA could be increased as a way to inhibit TNF- translation. These results suggest the importance in understanding how human miRNAs could regulated the HTLV-1 infection. In addition to this, they could generate data to be used as therapeutic strategies for the control of viral replication and pathogenic processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02032009-112507 |
| Date | 27 February 2009 |
| Creators | Nicolete, Larissa Deadame de Figueiredo |
| Contributors | Haddad, Simone Kashima |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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